الجيش الملكي النيبالي المنسدلة الإجراء لتحديد أهداف الجيش الملكي النيبالي للجيش الملكي النيبالي منذ فترة طويلة غير الترميز

الهدف العام من هذا الإجراء هو تحديد الشركاء الجزيئيين للحمض النووي الريبي للحوض النووي الريبي الطويلة غير المشفرة ذات الأهمية. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في فك تشفير الوظائف البيولوجية للحمض النووي الريبي الطويل غير المشفر من خلال توفير معرفة مهمة جديدة حول تنظيم الحمض النووي الريبي عن طريق الحمض النووي الريبي الطويل غير المشفر. الميزة الرئيسية لهذه الطريقة هي أنها قابلة للاستخدام في معظم التطبيقات لأننا قمنا بتحسينها ، أولا للعديد من الحمض النووي الريبي الطويل غير المشفر والثاني لكل من الخلايا المستنبتة ومستخلصات الأنسجة.

تعتمد طريقتنا على مزيج من طريقتين سابقتين ، ChIRP ، والتي تعني عزل الكروماتين عن طريق تنقية الحمض النووي الريبي ، و CHART ، وهو تحليل تهجين الالتقاط لأهداف الحمض النووي الريبي. خصوصية طريقتنا هي أن مجسات قليل النوكليوتيدات تم تصميمها باستخدام نمذجة المعلوماتية الحيوية لبنية ثانوية من الحمض النووي الريبي الطويل غير المشفر وكان هدفه تحديد أهداف الحمض النووي الريبي. سيظهر الإجراء فنيان من فريقي ، بينيديكت بوير وسيفيرين جيلين.

بعد زراعة خلايا GH4C1 وفقا لبروتوكول النص ، قم بإزالة الوسيط من لوحة زراعة الخلية واستخدم حجما واحدا من PBS لشطف الخلايا. أضف 10 ملليلتر من 1٪ PFA في PBS لإصلاح الخلايا. ثم قم بربط الخلايا تحت التحريض في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق.

قم بإخماد عمل PFA عن طريق إضافة 1 مليلتر من 1.25 مولار جلايسين وتحريك العينة في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق. بعد ذلك ، تخلص من المحلول عن طريق الشفط واستخدم 10 مل من PBS لشطف الطبق مرتين لمدة خمس دقائق لكل منهما. بعد ذلك ، أضف ملليلترا واحدا من PBS ، واستخدم مكشطة خلية لجمع الخلايا ، ونقلها إلى أنبوب الطرد المركزي.

قم بتدوير العينة عند 510 جم وأربع درجات مئوية لمدة خمس دقائق. بعد ذلك ، قم بإزالة أكبر قدر ممكن من المواد الطافية وقم بتخزين الكريات إلى أجل غير مسمى عند سالب 80 درجة مئوية. لإجراء ربط الأنسجة ، اغمر خمسة ملليغرامات من أنسجة الغدة النخامية التي تم الحصول عليها حديثا في حجم 10X من 1٪ PFA في PBS وقم بتحريك العينة في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق.

قم بإخماد PFA بإضافة 0.05 مل من محلول جلايسين 1.25 مولار وتحريك الأنسجة في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق. استنشق الوسط واستخدم 0.5 مل من PBS لشطف الأنسجة مرتين. بعد إزالة أكبر قدر ممكن من المادة الطافية ، قم بتخزين الأنسجة المتشابكة إلى أجل غير مسمى عند سالب 80 درجة مئوية.

قم بإعداد المخزن المؤقت للتحلل ثم لتحليل العينات دون إذابة مسبقة. استخدم المخزن المؤقت لإعادة تعليق العينات في ما يقرب من مليلتر واحد لكل 100 ملليغرام من حبيبات الخلية أو الأنسجة. ضع العينات المحللة في حمام مائي بدرجة أربع درجات مئوية وابدأ سلسلة الصوتنة المحسنة وفقا لبروتوكول النص.

مباشرة بعد صوتنة ، قم بالطرد المركزي للعينات عند 12 ، 000 جم وأربع درجات مئوية لمدة خمس دقائق. ثم انقل المواد الطافية إلى أنابيب جديدة. يجب تحسين سلسلة الصوتنة لتكون فعالة بما يكفي لتقليل اللزوجة من الحمض النووي دون الحصول على الحمض النووي الريبي المجزأ الآخر.

لإجراء التهجين على العينات الصوتية ، أضف مجلدين من المخزن المؤقت للتهجين إلى الأنابيب والدوامة. انقل 20 ميكرولترا من كل عينة إلى أنابيب طرد مركزي وخزنها عند سالب 20 درجة مئوية. أضف 100 بيكومول من مجسات قليل النوكليوتيدات الحيوية إلى كل عينة.

ثم احتضان العينات تحت تحريض معتدل على أنبوب دوار في درجة حرارة الغرفة لمدة أربع إلى ست ساعات. بعد الحضانة ، أضف 50 ميكرولترا من حبات الستربتافيدين المغناطيسية المكملة ب 200 وحدة لكل مليلتر من محلول مثبط RNase و 5 ميكرولتر لكل مليلتر كوكتيل مثبط البروتياز إلى العينات. احتضان الأنابيب في درجة حرارة الغرفة تحت تحريض معتدل على دوار الأنبوب طوال الليل.

في اليوم التالي ، قم بعزل الحمض النووي الريبي عن طريق وضع الأنابيب على دعامة مغناطيسية وتخلص من المادة الطافية. بعد ذلك ، أضف 900 ميكرولتر من مخزن الغسيل إلى الخرز وضع الأنابيب على دوار في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق. ثم ضع العينات على المغناطيس ، وتخلص من المخزن المؤقت ، وكرر الغسيل خمس مرات.

بعد إزالة الغسيل النهائي ، أضف 95 ميكرولترا من محلول البروتيناز K وخمسة ميكرولترات من 20 ملليغرام لكل مليلتر من البروتيناز K إلى العينة. ثم ، على الجليد ، قم بإذابة عينات الإدخال وأضف 75 ميكرولترا من محلول البروتيناز K وخمسة ميكرولترات من البروتيناز K. احتضان العينات عند 50 درجة مئوية لمدة 45 دقيقة ، ثم عند 95 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.

قم بتبريد العينات على الجليد لمدة ثلاث دقائق ، ثم ضعها على المغناطيس واجمع المادة الطافية التي تحتوي على الحمض النووي الريبي وتخلص من الخرز. استخدم مجموعة تنقية الحمض النووي الريبي لتنقية الحمض النووي الريبي. أخيرا ، قم بتخزين الحمض النووي الريبي عند سالب 80 درجة مئوية وقم بإجراء RT و qPCR وبناء مكتبات الحمض النووي وفقا لبروتوكول النص.

استنادا إلى نمذجة المعلوماتية الحيوية للهيكل الثانوي lncRNA الموضح هنا ، تم تصميم المجسات ضد اثنين من lncRNAs ، الفئران Neat1 أو Malat1 للخلايا المستنبتة GH4C1 والفأر Neat1 لمستخلصات أنسجة الغدة النخامية. تم حساب التخصيب النسبي ل Neat1 أو Malat1 للمجسات غير المحددة والمحددة بالنسبة لعينات المدخلات. يوضح هذا الشكل كفاءة المجسات المحددة لسحب Neat1 في خط خلايا الغدة النخامية GH4C1 للفئران وفي مستخلصات أنسجة الغدة النخامية للفأر.

عندما تم توجيه بروتوكول قليل النوكليوتيدات أو مجسات SO إلى Malat1 ، تم إنشاء مسبار فعال واحد جنبا إلى جنب مع مسبار واحد غير فعال تم التخلص منه. بعد سحب الحمض النووي الريبي و RT qPCR ، ارتبطت الحمض النووي الريبي المرتبط ب Neat1 في مستخلصات خلايا GH4C1 أيضا ب Neat1 في مستخلصات أنسجة الغدة النخامية. في الواقع ، بعد سحب Neat1 RNA ، تم العثور على Malat1 ليتم استهدافه بواسطة Neat1 في كل من خط خلايا GH4C1 وفي مستخلصات أنسجة الفئران النخامية.

بالإضافة إلى ذلك ، تم إثراء Neat1 بشكل كبير بعد إجراء سحب Malat1 RNA باستخدام المسبار في خلايا GH4C1. تتوافق العلاقة الوثيقة التي تم تحديدها بين lncRNAs مع الدور التنظيمي المشترك المحتمل ل Neat1 و Malat1 ، والذي اقترحته الفئران بالضربة القاضية Malat1 التي تعرض اختلافات في تعبير Neat1 RNA. بمجرد إتقانها ، تتيح هذه التقنية في غضون يومين أو ثلاثة أيام التقاط أهداف الحمض النووي الريبي لحمض نوبي طويل غير مشفر مرغوب.

باستخدام نهج المعلوماتية الحيوية ، من المهم تصميم العديد من المجسات المضادة للمعنى ثم مقارنة كفاءتها تجريبيا لأن كفاءة المسبار قد تتغير بواسطة مستحضرات محللة الخلية. باتباع هذا الإجراء ، يمكن إجراء تسلسل الحمض النووي الريبي عالي الإنتاجية من أجل توفير تفاعل الحمض النووي الريبي الكامل لحمض الرينا الريبي الطويل غير المشفر ذي الأهمية. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية التقاط شركاء الحمض النووي الريبي لRNA طويل غير مشفر باستخدام مجسات فعالة ومحددة تهجن إلى المناطق المتاحة من الحمض النووي الريبي الطويل غير المشفر كما هو محدد بواسطة نمذجة المعلوماتية الحيوية لهيكله الثانوي.