طرق التسليم الشفوي الحمض النووي الريبي مزدوج-الذين تقطعت بهم السبل للحث على تدخل الجيش الملكي النيبالي في لحاء وتغذية النبات-ساب الحشرات هيميبتيران

الهدف العام من هذه الإجراءات هو إظهار طريقة التوصيل الفموية الطبيعية. بالنسبة ل dsRNAs الخاصة بالجينات ، للحث على تداخل الحمض النووي الريبي في الجسم الحي والآفات الحشرية. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية حول كيفية توصيل الجزيئات الحيوية داخل الحشرات ، لتوضيح تأثير المبيدات الحيوية الجزيئية القائمة على الحمض النووي الريبي ، والسيطرة على الحشرات في البيئة.

الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أن هذا التوصيل من خلال إسكات الجينات بوساطة الحمض النووي يمكن تطبيقه على تغذية عصارة النبات وكذلك مضغ الحشرات. على الرغم من أن الطرق هنا توضح توصيل الحمض النووي الريبي مزدوج الشريطة إلى الآفات النصفية ، مثل حشرة الرائحة الكريهة ذات اللون البني ، وحشرة المهرج ، وحشرة الحمضيات الآسيوية. يمكن تطبيقها على الحشرات الأخرى.

لبدء البروتوكول ، حدد حشرة الرائحة الكريهة ذات اللون البني الرابع في وقت مبكر ، أو حووريات BMSB ، التي تفقس من كتلة البيض ، وتجويعها لمدة 24 ساعة قبل تغذية dsRNA. بعد ذلك ، اختر الفاصوليا الخضراء العضوية الرفيعة والمعتمدة واغسلها بمحلول هيبوكلوريت الصوديوم 0.2٪ لمدة خمس دقائق. اتبعها بثلاث غسلات H2O مزدوجة المقطر ، واترك الفاصوليا تجف في الهواء.

بمجرد أن تجف ، قم بقص الفاصوليا الخضراء من نهاية الكأس إلى طول إجمالي يبلغ 7.5 سم باستخدام شفرة حلاقة نظيفة. اغمر الفاصوليا الخضراء المغسولة والمقطعة في أنبوب طرد مركزي دقيق بدون غطاء سعة ملليلترين يحتوي على 300 ميكرولتر من محلول التحكم. قم بعمل تخفيفات من lac Z أو JHAMT أو VGDSRNAs المركبة في المختبر ، عن طريق تخفيف 5 ميكروغرام ، أو 20 ميكروغراما ، و 300 ميكرولتر من الحمض النووي الريبي ، والماء الخالي من الحمض النووي لإنتاج تركيزات نهائية تبلغ 0.017 ميكروغرام لكل ميكرولتر ، أو 0.067 ميكروغرام لكل ميكرولتر على التوالي.

اغمر الفاصوليا الخضراء المغسولة والمقطعة في أنبوب طرد مركزي دقيق بدون غطاء سعة ملليلترين ، يحتوي على 300 ميكرولتر من محلول dsRNA. لف وختم حواف أنابيب الطرد المركزي الدقيقة ، مع إحاطة الحبوب المغمورة لمنع تبخر محلول dsRNA ، ولمنع من دخول أنبوب الطرد المركزي الدقيق. ضع الأنابيب في وضع مستقيم في درجة حرارة الغرفة لمدة ثلاث ساعات ، للسماح لمحلول dsRNA بالتحميل في جميع أنحاء الفاصوليا الخضراء عن طريق العمل الشعري.

ضع الأنابيب في أوعية استزراع نظيفة من مادة البولي بروبلين ، وضع 3 حوريات BMSB من الطور الرابع في أوعية الاستزراع. عالج ثلاث حشرات لكل وعاء استزراع. يحتوي كل منها على ثلاث فاصوليا خضراء مع تلوين طعام أخضر ، أو محلول dsRNA.

حافظ على الحشرات عند 25 درجة مئوية و 72٪ رطوبة نسبية ، تحت 16 لترا ، 8D فترة ضوئية في حاضنة. اسمح للحشرات بالتغذية على الفاصوليا الخضراء المغمورة والممتصة في dsRNA لمدة خمسة أيام ، وقم بتجديدها بوجبات غذائية طازجة من الفاصوليا الخضراء المعالجة ب dsRNA بعد ثلاثة أيام. اختر النباتات أو الشتلات ، ولا تسقيها لمدة يومين إلى ثلاثة أيام قبل الاستخدام ، للسماح للتربة بالجفاف حتى تصبح رطبة ، ولكن لا تجف تماما.

باستخدام زجاجة رذاذ يتم ضخها يدويا ، ضع 200 مل من محلول dsRNA على المظلة السفلية. قم بتذوق النمو الجديد من الأشجار التي تم تصدرها سابقا بعد 25 إلى 40 يوما ، عن طريق جمع ما يقرب من 10 أوراق من أطراف أربعة فروع. استخرج إجمالي الحمض النووي الريبي ، وقم بتحليله بواسطة RT-PCR و qPCR لوجود مشغل dsRNA المطبق.

وبالمثل ، قم برش 10 مل من dsRNA موضعيا على المنطقة السفلية من الشتلات ، أو أوراق الشجر ذات الأصص الصغيرة. اختر النباتات أو الشتلات ، ولا تسقيها لمدة يومين إلى ثلاثة أيام قبل الاستخدام ، للسماح للتربة بالجفاف ، رطبة ، ولكن لا تجف تماما. بعد ذلك ، أضف لترا واحدا من محلول dsRNA إلى تربة النباتات ذات الأصص الكبيرة.

أضف لترا واحدا من الماء بعد ساعة. ضع 100 مل من محلول dsRNA على تربة الأشجار المحفوظة بوعاء التي يبلغ ارتفاعها مترا واحدا في التربة الجافة جزئيا. اسمح للنباتات بتلقي محلول dsRNA كغمر في التربة ، لينقع لمدة 30 دقيقة.

ثم ضع معالجة عادية بالماء فقط للمساعدة في امتصاص الجذور. اختر شتلات الحمضيات أو النباتات الجديدة أو التي يبلغ عمرها حوالي 3.5 سنة لحقن الحمض النووي الريبي dsRNA باستخدام صنبور الساق ، المعروف أيضا باسم طريقة حقن الجذع. لف الطرف النحاسي لكل حاقن من أربع إلى ست مرات بشريط بعرض 0.6 سم من فيلم السقف لمنع التسرب بالقرب من الحافة.

بعد ذلك ، املأ حاقنات جذع الشجرة بستة ملليلتر من محلول dsRNA المخفف بالحمض النووي والماء الخالي من الحمض النووي الريبي. احفر ثقوبا في نباتات الحمضيات باستخدام مثقاب سعة 10 مليلتر ، واحرص على ألا يتجاوز سنتيمترين ، أو حوالي نصف قطر الساق. بعد ذلك ، قم بحقن المحلول في جذع الشجرة ، واترك الحاقن في الجذع لمدة ست إلى 10 ساعات للسماح بامتصاص محلول dsRNA.

دع الحشرات تتغذى على قصاصات الأشجار المعالجة في 3 و 10 و 30 يوما بعد العلاج. اسكب 30 جراما من مادة الطين الماصة في أنبوب مخروطي سعة 50 مليلتر إلى علامة 35 ملليلترا. صب 20 مل من محلول dsRNA المخفف في الحمض النووي والماء الخالي من الحمض النووي الريبي في الأنبوب لترطيب كل المادة الماصة.

قم بتغطية الأنبوب المخروطي ، وقلب الأنبوب للمساعدة في إزالة الهواء ، وضع الأنبوب في وضع مستقيم ، واتركه يقف لمدة دقيقة إلى دقيقتين بينما تمتص جزيئات الطين المحلول. أضف ما يكفي من الطين المنقوع بالحمض النووي الريبي في مزيج التربة لملء وعاء جالون واحد. امزج التربة واقلبها يدويا لخلط الطين المنقوع بالحمض النووي الريبي في التربة جيدا.

استخدم التربة لإعادة وضع الشتلات المختارة لمعالجة dsRNA. سقي التربة ب 200 مل من الماء العادي ، بدون dsRNA ، بعد 30 دقيقة إلى ساعة واحدة. يتبع ذلك ب 100 مل من الماء العادي.

بعد 24 ساعة ، ضع النبات في جدول سقي عادي. اختبر أربع إلى ست أوراق من النباتات المعالجة بوعاء بمواد ماصة للطين و dsRNA كل شهر ، بعد المعالجة ل dsRNA ، عن طريق جمع الأوراق القمية لنمو النبات الجديد. أشار QPCR لشرائح الفاصوليا الخضراء المغمورة في dsRNA المركب في المختبر ، خاص بحشرة الرائحة الكريهة البنية ، أو BMSB mRNA ، إلى الحث الناجح ل RNAi حيث تم تقليل التعبير عن الأهداف JHAMT و Vg بشكل كبير في الجسم الحي.

طريقة التوصيل هذه فعالة أيضا على آفة نصفية أخرى ، حشرة المهرج. كما يتضح من فضلاتها ذات اللون الأخضر. بعد مشاهدة هذه العروض التوضيحية ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية توصيل الحمض النووي الريبي المزدوج الشريطة إلى الحشرات من خلال الابتلاع الفموي لتحفيز حشرات الحمض النووي الريبي في الجسم الحي.

تستمر التطورات التي يتم إحرازها في تقنية RNAi nucelotide في توسيع قدرات الباحثين على تعديل الحمض النووي الريبي والتعبير الجيني ومستويات البروتين في مجموعة واسعة من الكائنات الحية. هذا ينتقل من النباتات إلى الحشرات وأصعب الكائنات الحية الدقيقة. لذلك بينما تستمر تكلفة إنتاج الحمض النووي الريبي المزدوج في الانخفاض ، وتستمر طرق التسليم والاستقرار في التحسن ، سيستمر استخدام مستقبل تقنيات الحمض النووي الريبي لحل المشكلات الناشئة والمعقدة.