السريع في فيفو تقييم لقدرات توليد الخلايا اللمفية T السامة للخلايا Adjuvant في لتطوير اللقاحات

الهدف العام من هذه التجربة هو تحديد قدرة المواد المساعدة ذات الأهمية على توليد الخلايا الليمفاوية التائية السامة للخلايا من خلال مراقبة تكاثر الخلايا التائية الملطخة ب OT1 CD8 الملونة بالتبني في الغدد الليمفاوية والطحال للحيوانات المتلقية المحصنة. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال علم اللقاحات مثل فاعلية العامل المساعد لتوليد استجابة خلية السمية الخلوية. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنه لا يمكنك تحديد سعة CTL للمادة المساعدة فحسب ، بل أيضا ما إذا كان هذا محليا أو نظاميا ويمكنك القيام بذلك فقط في أربعة أيام.

ستظهر الإجراء فني في مختبرنا ، إيلينا راينهارد. لعزل الفخذ 1.1 إيجابية CD8 الخلايا التائية الإيجابية من الفئران OT1 ، قم أولا بحصاد الطحال والغدد الليمفاوية الأربية والإبطية وعنق الرحم وفقا للبروتوكولات القياسية التي تضع جميع الأعضاء في مصفاة شبكية مسام 100 ميكرومتر في طبق بتري 60 ملم يحتوي على ثلاثة إلى خمسة ملليلتر من الوسط الكامل على الجليد لكل فأر أثناء جمعها. لا تحصد في طحال OT1 أو الغدد الليمفاوية الكبيرة لأن الخلايا التائية من هذه الأنسجة الليمفاوية قد تكون بيضاء الدماغ وسوف تتكاثر حتى بدون تحفيز يربك نتائج الفحص.

عندما يتم استرداد جميع الأعضاء من كل متبرع ، استخدم مكبس حقنة لهرس العينات من خلال المرشح الشبكي ونقل المعلقات المفردة الناتجة إلى أنبوب مخروطي واحد سعة 15 مليلتر لكل فأر. بيليه الخلايا عن طريق الطرد المركزي ، متبوعا بغسل بالطرد المركزي في 10 مل من PBS البارد. تحلل حبيبات خلايا الدم الحمراء في مليلتر واحد من عازلة كلوريد الأمونيوم لكل أنبوب على الجليد.

بعد 90 ثانية ، اغسل الخلايا في 10 ملليلتر أخرى من PBS وأعد تعليق الخلايا في مليلتر واحد من PBS بالإضافة إلى 5٪ FBS لكل أنبوب. ثم استخدم مجموعة انتقائية سلبية لعزل الخلايا التائية الإيجابية CD8 وفقا لبروتوكولات عزل الخرزة المغناطيسية القياسية وحساب عدد الخلايا التائية الإيجابية CD8 التي تم فرزها بالخرزة المغناطيسية. بعد ذلك ، قم بتخفيف الخلايا التائية إلى واحد إلى خمسة × 10 إلى الخلايا السابعة لكل مليلتر من تركيز PBS في أنابيب مخروطية فردية سعة 15 مليلتر وقم بتلطيخ كل عينة خلية بخمسة ميكرومولار CFSE لمدة سبع دقائق عند 37 درجة مئوية ومحمية من الضوء.

في نهاية الحضانة ، قم بإخماد تفاعل التلوين بحجم متساو من FBS وأعد الخلايا إلى حاضنة 37 درجة مئوية لمدة سبع دقائق إضافية. في نهاية الحضانة الثانية ، اغسل الخلايا مرتين في 10 ملليلتر من PBS لكل غسلة وأعد تعليق الخلايا في ثلاثة إلى خمسة × 10 إلى الخلايا السابعة لكل حجم مليلتر من PBS. للنقل بالتبني لخلايا OT1 T المسماة CFSE ، قم بتحميل الخلايا في حقنة واحدة سعة مليلتر واحدة مزودة بإبرة قياس 25 لكل عينة خلية تجريبية وشل حركة الفأر المتلقي الأول في مقيدة.

ثم عندما تتوسع أوردة الذيل ، قم بتوصيل 100 ميكرولتر من الخلايا عبر وريد الذيل الجانبي أو الظهري. لتحصين المنقولة بالتبني ، احلق الفراء فوق الألوية السطحية للفأر المزروع بالخلايا التائية OT1 واستخدم إبرة قياس 25 لحقن 50 ميكرولترا من OVA الخالي من السموم الداخلية تحت الجلد في المنطقة المحلوقة. من المهم استخدام OVA الخالي من السموم الداخلية لأن آثار السموم الداخلية في OVA يمكن أن تقودك إلى نتائج خاطئة.

بعد ثمان وأربعين ساعة من التحصين ، قم بحصاد الغدد الليمفاوية الأربية والطحال من كل متلقي وفقا للبروتوكولات القياسية وقم بإنشاء معلقات فردية أحادية الخلية لكل عينة من العقدة الليمفاوية والطحال كما هو موضح للتو. اجمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي وأعد تعليق الكريات في 100 ميكرولتر من PBS لكل عينة. لتلطيخ العينات لتحليل قياس التدفق الخلوي ، احتضان الخلايا ب 100 ميكرولتر من كوكتيل الأجسام المضادة الأولية المترافقة بالفلوروفور لمدة 30 دقيقة عند أربع درجات مئوية.

في نهاية الحضانة ، اغسل الخلايا مرتين في 10 ملليلتر من PBS وأعد تعليق العينات في 0.5 إلى مليلتر واحد من PBS لكل أنبوب. قم بتصفية الخلايا من خلال مصافي من 70 إلى 100 ميكرومتر في أنابيب تحليل قياس التدفق الخلوي بخمسة ملليمترات واحصل على عناصر التحكم في تعويض التلوين الفردي بالإضافة إلى العينات الموجودة في مقياس التدفق الخلوي. لبوابة العينات، افتح ارتفاع مبعثر أمامي مقابل مخطط منطقة التشتت الأمامي ومخطط منطقة التشتت الجانبي مقابل مخطط منطقة التشتت الجانبية والبوابة لاستبعاد المضاعفات.

قم بإنشاء مخطط FITC مقابل مؤامرة مضان تلقائي من أجل التمييز بين عدد الخلايا الملطخة ب CSFE الحقيقية وخلايا الفلورسنت التلقائية العالية. قم ببوابة هذه الخلايا الملطخة OT1 CSFE كمجموعات تمتد في الغالب على محور FITC. للتمييز بين الخلايا المشتقة من المانحة مقابل المتلقية ، قم ببوابة الفخذ 1.1 بالإضافة إلى CD90 0.1 بالإضافة إلى CD8 بالإضافة إلى الخلايا التائية وأعد بوابة CD8 بالإضافة إلى السكان لاستبعاد الخلايا التائية CD4 plus.

ثم اعرض هذه الخلايا التائية CD8 المتكاثرة في رسم بياني وفقا لتعبير CSFE الخاصة بهم وقم ببوابة المجموعات المتكاثرة من 10 إلى الثانية حتى كثافة السكان غير المقسمة. الحصول على ما لا يقل عن 5,000 حدث لضوابط التعويض و 10,000 حدث لكل عينة بمعدل تحليل تدفق منخفض أو متوسط. في هذه التجربة ، تم تطعيم مجموعتين من الفئران بواحد من اثنين من المواد المساعدة المختلفة.

أظهرت الفئران التي تم حقنها ب OVA بالإضافة إلى العامل المساعد الثاني قدرة أعلى على توليد الخلايا التائية السامة للخلايا محليا في الغدد الليمفاوية المستنزفة مقارنة بالفئران التي تم حقنها بالعامل المساعد الأول بالإضافة إلى OVA أو OVA وحده أو لقاح التحكم في PBS. في المقابل ، في الفئران التي تم حقنها بالعامل المساعد الثاني بالإضافة إلى OVA لم يولد استجابة للخلايا التائية السامة للخلايا في حجرة جهازية بينما أظهرت الخلايا التائية الإيجابية CD8 المعزولة من طحال الفئران المساعدة واحدة بالإضافة إلى OVA مستويات أعلى من التكاثر مقارنة بالخلايا التائية الإيجابية للطحال CD8 المعزولة من OVA وحدها ، والتحكم في PBS ، ومساعدين اثنين بالإضافة إلى الملقحة OVA. بمجرد إتقانها ، ستسمح لك هذه التقنية بتحديد سعة CTL للجزيء المساعد باستخدام مستضد OVA في أربعة أيام فقط من العمل.

بعد إجراء هذه التقنية ، ستتمكن من تطبيق جميع التقنيات الأخرى على الخلايا التائية المعزولة ثم على النمط الظاهري لملف تعريف السيتوكين أو الملف الأيضي لاستجابة CTL للمساعد الخاص بك.