التنمية والتحقق من جزيء واحد أولتراسينسيتيفي الصفيف الرقمي المرتبط بالانزيم مقايسة الممتز للبشرية انترفيرون-α

يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية حول طبيعة الاستجابات المستحثة بالإنترفيرون وتنظيمها وتأثيرها البيولوجي في بيئات المرض المختلفة ، بما في ذلك المناعة الذاتية والعدوى. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي حساسيتها الرئاسية. تتمتع هذه التقنية بإمكانيات كبيرة لاكتشاف المؤشرات الحيوية لتحسين إدارة المريض في العديد من الأمراض حيث يمكنها تحديد السيتوكينات بحساسية غير مسبوقة.

كانت الخطوة الرئيسية في هذا النهج هي تحييد الأنشطة المتعلقة بالمرضى الذين يعانون من نظام البولي إندوكرين المناعي الذاتي من النوع الأول. للبدء ، قم بتحميل 280 مليون حبة مغناطيسية في أنبوب ميكرو فوج ، مع ملاحظة الحجم. ثم نبض تدوير الخرز وضع الأنبوب على فاصل مغناطيسي لمدة دقيقة.

قم بإزالة المحلول المخفف والتخلص منه وبالتالي عزل الخرز. بعد ذلك ، اغسل الخرزات باستخدام BWB مرتين و BCB مرتين. لكل غسلة ، أضف 200 ميكرولتر وقم بتدوير الأنبوب لمدة خمس ثوان.

ثم افصل الخرزات عن المحلول باستخدام الفاصل المغناطيسي. بعد دقيقة واحدة من الانفصال ، تخلص من المخفف. بعد ذلك ، أضف 190 ميكرولتر من BCB لكل حجم حبة.

ثم قم بدوامة الأنبوب لفترة وجيزة ، وقم بتدوير الأنبوب ، ووضع الخرزات المغسولة على الجليد. لتنشيط الخرزات ، امزج ملليلتر واحد من BCB البارد مع 10 ملليغرام من EDC ، ودوامة حتى يصبح المحلول متجانسا. اعمل بسرعة وأمان عند استخدام EDC ، نظرا لعدم الاستقرار المتأصل وحل الاعتدال.

ثم أضف 10 ميكرولترات من EDC البارد المخفف لكل حجم حبة إلى تعليق الخرزة ودوامة الخرز لفترة وجيزة. بعد ذلك ، ضع الخرز على شاكر في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة. لتصريف الأجسام المضادة للحبات ، تقوم الدوامة والنبض أولا بتدوير الخرزات المنشطة.

ثم ضع الخرزات في فاصل مغناطيسي لمدة دقيقة وتخلص من المادة الطافية BCB. بعد ذلك ، قم بإزالة الأنبوب من المغناطيس واغسل الخرزات مرتين باستخدام 200 ميكرولتر من BCB. ثم الدوامة ، والنبض يدور ، ويفصل الخرزات مغناطيسيا لإزالة المخزن المؤقت.

بعد ذلك ، أضف بسرعة 200 ميكرولتر من الجسم المضاد البارد المتبادل بالمخزن المؤقت إلى الخرزات المنشطة. بعد دوامة الخرز في المحلول ، ضع التعليق على شاكر درجة حرارة الغرفة لمدة ساعتين عند 1 ، 000 دورة في الدقيقة. ابدأ بإعطاء تعليق الخرزة المطلي بالأجسام المضادة نبضة ثم استخدم العمود المغناطيسي لإزالة المخزن المؤقت.

بعد ذلك ، تحقق من تركيز البروتين في المخزن المؤقت. استخدم مقياس الطيف الضوئي منخفض الحجم. في هذه المرحلة ، تقترن الأجسام المضادة بالخرز وأي قيمة أعلى من الصفر تعني أن الخرزات مشبعة بالأجسام المضادة.

الآن ، اغسل الخرزات ب 200 ميكرولتر من BWB ، كما تم إجراؤه في جميع عمليات الغسيل السابقة. ثم انقل المادة الطافية إلى أنبوب جديد وتحقق من تركيز البروتين. يسمح القياس الكمي للبروتينات التي يتم إطلاقها من الخرزات بقياس اقتران الأجسام المضادة.

ثم اغسل الخرزات ب 200 ميكرولتر من BWB مرة أخرى. بعد ذلك ، أضف 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت لحجب الخرزة ، وقم بتدوير الأنبوب لمدة خمس ثوان وانقله إلى شاكر درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة. بعد 30 دقيقة سيتم حظر الخرز.

ثم اغسلها مرة واحدة باستخدام 200 ميكرولتر من BWB ، متبوعا بغسلها مرتين باستخدام 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت المخفف للحبة لكل غسلة. بعد ذلك ، قم بتخزين الخرزات المطلية والمسدودة في 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت المخفف للحبة عند أربع درجات مئوية. يقترح هذا القسم من الفيديو استراتيجيات لكيفية تعديل ظروف الفحص باستخدام برنامج محلل مصفوفة الجزيء الفردي في تكوين التخمير المنزلي.

ابدأ باختبار مجموعات مختلفة من الخرز المترافق بالأجسام المضادة والأجسام المضادة للكشف عن البيوتينيل في كلتا مجموعتي الأجسام المضادة. بعد ذلك ، اختبر مجموعات من تركيزات الأجسام المضادة الثلاثة المختلفة مع نسبتين مختلفتين للبيوتينيل للكشف عن الأجسام المضادة والتقاطها والعكس صحيح. ثم اختر المجموعة التي توفر أدنى مستوى من الكشف واستخدمها لمزيد من الخطوات.

في هذه الحالة ، تعطي حصة 30 إلى واحدة من البيوتين إلى الجسم المضاد أفضل حد للكشف. بعد ذلك، قارن التكوين المكون من خطوتين بتكوين من ثلاث خطوات. تحتوي التكوينات المكونة من ثلاث خطوات على ثلاث خطوات حضانة مختلفة.

واحد مع الجسم المضاد للالتقاط ، والآخر بالجسم المضاد للكشف ، والثالث الأخير لوضع العلامات على إنزيم SBG. تجمع التكوينات المكونة من خطوتين بين حضانات الالتقاط والكشف. قم بتشغيل محلل المصفوفة أحادية الجزيء باستخدام تركيزات الأجسام المضادة للالتقاط والكاشف المحددة في التكوينات المكونة من خطوتين وثلاث خطوة، والتي تم تكوينها مسبقا في المحلل، باتباع تعليمات الشركة المصنعة.

ثم اختر التكوين الذي يسمح بأعلى حساسية واحتفظ به للخطوات المستقبلية. في هذه الحالة، يعطي التكوين المكون من خطوتين حساسية أعلى قليلا في كل نقطة اختبار. بعد ذلك ، قم بتحسين تركيزات الجسم المضاد للكاشف و SBG.

اختبر ثلاثة تركيزات مختلفة من الأجسام المضادة للكاشف بثلاثة تركيزات مختلفة من SBG. اختر التركيزات التي تعطي أعلى حساسية واحتفظ بها للخطوات المستقبلية. في هذه الحالة ، يكون 0.3 ميكروغرام لكل مليلتر من الجسم المضاد و 150 بيكا مولار SBG المستوى الأمثل للكشف مع مستويات خلفية منخفضة مع سعة متوسطة مصادفة.

للحصول على خطوات تحسين إضافية، راجع بروتوكول النص. هناك إجراءات لتحسين خصوصية الفحص وقابلية التكاثر ومقايسة لمنافسة البروتين. باستخدام اختبار محسن للكشف عن 13 فئة فرعية من الإنترفيرون ألفا ، تم تحليل البلازما والمصل في مرضى الذئبة الحمراء ومرضى JDM والضوابط الصحية.

تم الكشف عن مستويات عالية من بروتين الإنترفيرون ألفا في كلتا المجموعتين من المرض. يشير الخط المنقط إلى مستوى الكشف عن إليزا التقليدية المتوفرة تجاريا والتي لن تكتشف بروتين الإنترفيرون ألفا في مجموعات المرضى هذه ، على الرغم من الدور المعروف لهذا السيتوكين في هذه الأمراض. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تطوير مقايسة مصفوفة جزيء واحدة والتحقق من صحتها لتحليلك الذي تختاره.

أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر أنه أثناء اختيار الخلية للأجسام المضادة. منذ تطويره ، سمح هذا الاختبار بتوصيف أفضل لدور الإنترفيرون ألفا في مجموعة متنوعة من أمراض المناعة الذاتية والالتهابات. وقد عمل هذا الاختبار أيضا على مراقبة الاستجابات للعلاجات الجديدة وتحديد الجهات الفاعلة الخلوية المسؤولة عن بعض اضطرابات المناعة الذاتية.