الشريط الثغور-التقشير: طريقة محسنة لإعداد نموذج خلية الحرس

الهدف العام من هذه التجربة هو إعداد خلايا حارسة ثغور غنية عالية الجودة للتحليلات الفسيولوجية والكيميائية الحيوية والجزيئية ، مثل النسخ والبروتينات والتمثيل الغذائي. مرحبا ، اسمي شيلدون لورانس. أنا طالب دراسات عليا في مختبر الدكتور تشين في قسم الأحياء بجامعة فلوريدا.

اليوم ، سأوضح لك كيفية عزل الخلايا الحارسة من أنسجة أوراق النبات التي تعتبر مادة مفيدة لدراسة كل من فسيولوجيا وبيولوجيا الثغور. تعتبر هذه الطريقة طريقة جديدة لعزل خلايا الحراسة. يسمح على وجه التحديد بتخصيب خلايا الحراسة السليمة ويوفر عينات موثوقة لدراسة عمليات إشارات خلايا الثغور.

يمكن أن يمتد تطبيق هذه الطريقة إلى نباتات الكرنب والأنواع النباتية الأخرى مع تعديل بسيط فقط على البروتوكول. العرض التوضيحي مهم لأن الخطوة الرئيسية لإثراء خلايا الحراسة يمكن أن تكون صعبة. للبدء ، اختر نباتات نبات نبات الأرابيدوبسيس الناضجة التي يبلغ عمرها خمسة أسابيع.

قم بإزالة ورقة بعناية بمشرط ، وقطع الورقة من القاعدة. خذ قطعتين من الشريط اللاصق وضع الورقة المقطوعة بينهما. اضغط برفق على كلا الجانبين مع التأكد من عدم التصاق نهاية قطع الشريط.

يمكن القيام بذلك عن طريق إدخال إصبع بينهما. قم بإزالة قطعتين من الشريط برفق بعيدا عن بعضهما البعض ، وقم على الفور بتعويم القشرة المأخوذة من الجانب البطني للورقة في عازلة فتح الثغور. بعد جمع كل القشور ، ضعها تحت الضوء.

اتركهم هناك لمدة ساعتين. خذ عدة قشور وضعها على شرائح المجهر. باستخدام مجهر ضوئي ، اضبط العدسات لعرض الخلايا الحارسة والتأكد من أنها مفتوحة.

ضع القشور في 50 مل من محلول إنزيم هضم جدار الخلية. تطفو وتحتضنها عند 26 درجة مئوية. بعد 20 دقيقة ، قم بإزالة القشور من محلول الإنزيم واشطفها مرتين لفترة وجيزة بالماء منزوع الأيونات ، وضعها في عازلة فتح الثغور الطازجة.

طحن القشور في هاون بالنيتروجين السائل باستخدام مدقة. ثم قم بإجراء استخراج الفينول كما هو موضح في النص. بعد طحن القشور في الهاون باستخدام مدقة ، انقل المستخلص مع القشور إلى أنبوب الطرد المركزي Oak Ridge ، وحرك على شاكر لمدة ساعة عند أربع درجات مئوية.

قم بترسيب البروتينات المستخرجة من الفينول عن طريق إضافة خمسة أحجام من أسيتات الأمونيوم المثلجة 0.1 مول في 100٪ ميثانول. بعد ترسيب البروتين طوال الليل عند 20 درجة مئوية ، قم بحصاد البروتين عن طريق الطرد المركزي وقم بغسل الحبيبات كما هو موضح في النص. أعد تعليق الحبيبات في مليلتر واحد من الأسيتون البارد ، وانقلها إلى أنبوب طرد مركزي صغير سعة ملليلتر.

بعد الطرد المركزي ، تخلص من مادة الأسيتون الطافية وجفف الحبيبات لمدة عشر دقائق. قم بإذابة عينة البروتين في مخزن مؤقت للذوبان. بعد الدوامة والطرد المركزي ، اجمع المادة الطافية وقم بقياس تركيز البروتين.

قم بتشغيل جل SDS-PAGE. تصور نطاقات البروتين المنفصلة ومراقبة جودة البروتين النسبية. هذه صورة تمثيلية لخلايا حراسة نبات الأرابيدوبسيس قبل وبعد هضم الإنزيم لخلايا الميزوفيل والبشرة.

يمكن ملاحظة صلاحية الخلية الحارسة قبل وبعد إزالة الخلايا المتوسطة والبشرة باستخدام ثنائي أسيتات الفلورسين ، الذي يقيس النشاط الأنزيمي وسلامة غشاء الخلية. كما ترون ، لا تزال الخلايا الحارسة قابلة للحياة بعد التقشير وهضم الإنزيم. يوضح هذا المثال حركة ثغور نبات الأرابيدوبسيس استجابة لعلاج ABA.

تستجيب الخلايا الحارسة للعلاج وتقل فتحة الثغور بأكثر من 50٪ بعد 30 دقيقة من العلاج باستخدام ABA. هنا مسار زمني لحركة الثغور. بالإضافة إلى ذلك ، يتم عرض صورة تمثيلية لفتحة الثغور في كل نقطة زمنية.

لوحظ اكتشاف البروتين وفصله ووفرة نسبية بواسطة SDS-PAGE. العصابات واضحة ومميزة. يتم تضمين أربعة مكررات بيولوجية للتأكيد على قابلية استنساخ استخراج البروتين من هذه الطريقة.

خطرت لنا فكرة هذه الطريقة لأول مرة عندما حاولنا ربط التغيرات الجزيئية للخلايا الحارسة في الوقت الفعلي بحركة الثغور. بمجرد إتقانها ، يمكن تحضير عينة بروتين من خلايا ثغور حارسة في غضون ساعات قليلة ويمكن استخدامها في تجارب متعددة. من المهم أن تتذكر عدم إلحاق قدر كبير من الضرر بالخلايا الحارسة أثناء التقشير والمناولة.

باتباع هذه الطريقة ، يمكن تطبيق تقنيات أخرى للتحقيق في إشارات الخلايا الحارسة ، مثل وضع العلامات متساوية الضغط لدراسة استجابة التكرار للبروتينات في النباتات في الظروف الطبيعية والإجهاد. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية عزل وإثراء الخلايا الحارسة السليمة والقابلة للحياة ، بالإضافة إلى استخراج البروتين عالي الجودة المناسب للدراسات النهائية.