طرق "كشف السامة للخلايا أميلويدس التالية العدوى من الرئة خلايا بطانية" الزائفة الزّنجاريّة

يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال الرعاية الرئوية ، مثل لماذا يعاني المرضى الذين نجوا من الالتهاب الرئوي المكتسب في المستشفى من مثل هذه النتائج السيئة على المدى الطويل؟ ميزة هذه الطريقة هي أنها بسيطة وموثوقة ، مما يعني أن أي شخص يأتي إلى المختبر يمكن تعليمه وفي اليوم التالي يقومون بإنشاء بيانات مفيدة وقابلة للتكرار. على الرغم من أنه يمكن تطبيق هذه الطرق التحليلية لتوفير نظرة ثاقبة لعدوى الخلايا المستنبتة في المختبر ، إلا أنه يمكن تطبيقها أيضا على النماذج الحيوانية والمرضى البشريين.

لإنتاج مادة طافية سامة للخلايا ، اغسل طبقا بطول 150 سم من الخلايا البطانية باستخدام HBSS ، وقم بتخفيف مستعمرة P.aeruginosa إلى امتصاص 0.25 عند 540 نانومتر. مزيد من التخفيف الخلايا البكتيرية'للسماح بتعدد العدوى من 20 إلى واحد في 20 ملليلتر من HBSS وبذر البكتيريا على صفيحة الخلايا البطانية. ثم ضع الخلايا المصابة في حاضنة 37 درجة مئوية و 5٪ CO2 لمدة أربع إلى خمس ساعات.

من الضروري أن تحدث حضانة البكتيريا والخلايا البطانية لفترة زمنية مناسبة. إذا كانت الحضانة قصيرة جدا ، فلن يتم إطلاق الأميلويدات في المادة الطافية. إذا كانت الحضانة طويلة جدا ، فستقوم الخلايا بالفعل بتحلل وتطلق جميع محتوياتها في المادة الطافية.

المؤشر الذي نستخدمه لمدة مناسبة من الحضانة هو تكوين فجوات في الطبقة الأحادية البطانية. عندما يمكن ملاحظة الفجوات في الطبقة الأحادية للخلية عن طريق المجهر الضوئي ، تحصد المادة الطافية للطرد المركزي لإزالة أي حطام خلوي. صب المادة الطافية في حقنة مزودة بفلتر 0.2 ميكرون وتمرير المادة الطافية عبر الفلتر لإزالة أي بكتيريا ملوثة.

ثم ضع جانبا 1.5 مل من المادة الطافية المعقمة لاختبار السمية الخلوية وقم بتجميد باقي العينة عند 80 درجة مئوية تحت الصفر. لتقييم السمية الخلوية للطافي المحصود ، أضف 1.5 ملليلتر من المادة الطافية المعقمة بالترشيح إلى بئر واحد من صفيحة من ستة آبار تحتوي على ثقافة الخلايا البطانية الوعائية الدقيقة الرئوية المتقاربة. ضع الطبق في حاضنة CO2 لمدة 21 إلى 24 ساعة.

ثم احصل على صور لمناطق الثقافات المعالجة والسيطرة. قم باستيراد الصور إلى ماكرو imagej مخصص واضبط التباين على 15٪ بكسل مشبع. قم بتكرار الصور المعدلة بالتباين واستخدم الخلفية الطرحية للحصول على صور عالية التباين لكل من الخلايا السليمة ومنطقة الفجوة داخل مجال الرؤية.

اطرح هذه الصورة عالية التباين من الصورة الأصلية واستخدم حاسبة الصورة ووظيفتها لدمج الصورة الناتجة مع الصورة الأصلية. استخدم وظيفة العتبة لتحويل الصورة المدمجة إلى قناع به فجوات باللون الأسود والخلايا السليمة باللون الأبيض. واستخدم وظيفة التآكل الثنائي لإزالة أي ضوضاء من الصورة.

ثم استخدم كسر المنطقة لقياس نسبة وحدات البكسل السوداء إلى البيضاء داخل الصورة الناتجة. ورسم والتعبير عن المناطق الكسرية لكل نقطة زمنية للعلاج ، كنسبة مئوية من مساحة الفجوة القصوى. لتحديد كمية الأميلويد داخل المادة الطافية ، أضف 20 ميكرولترا من محلول مخزون 50X من الثيوفلافين T المحضر والمفلتر حديثا إلى مليلتر واحد من PBS في كوفيت مقياس الطيف الضوئي بسعة مليلتر واحد ، وقم بتحميل العينة المخففة على مقياس الطيف الفلوري.

قم بقياس انبعاث التألق الأساسي باستخدام إثارة 425 نانومتر. مسح انبعاث التألق من 450 إلى 575 نانومتر بزيادتين نانومتر. ثم اضبط الأداة لإجراء مسح بفاصل زمني باستخدام إثارة 425 نانومتر وانبعاث 482 نانومتر مع الحصول على البيانات كل 0.2 ثانية لمدة 60 ثانية.

أوقف الفحص مؤقتا بعد 20 ثانية و 10 ميكرولتر من المادة الطافية المعقمة بالفلتر إلى الكوفيت. بعد الخلط عن طريق الانعكاس ، أعد تحميل الكوفيت على مقياس الطيف فلوري واستأنف الفحص المستند إلى الوقت لمدة 40 ثانية الأخيرة. عند الانتهاء من الفاصل الزمني ، قم بإجراء مسح نهائي لطيف الانبعاثات الفلورية باستخدام إعدادات المسح الأصلية.

تؤدي إضافة P.aeruginosa إلى طبقات متقاربة من الخلايا البطانية الوعائية الدقيقة الرئوية إلى تكوين فجوة بين الخلايا. باستخدام imagej لتقييم السمية الخلوية الطافية كما هو موضح خلال أول 12 ساعة من العلاج ، يمكن تصور الطبقات الأحادية للخلايا المتقاربة التي لا تزال صحية على أنها جميع المناطق البيضاء داخل المجال المجهري. ومع ذلك ، بعد 18 ساعة من إضافة المادة الطافية التي تم جمعها من الثقافات المصابة PA 103 ، يمكن اكتشاف فجوات في الطبقة الأحادية مع زيادة مساحة طبق الثقافة الخالية من الخلايا بطريقة خطية حتى 36 ساعة من العلاج ، وعند هذه النقطة لا يمكن ملاحظة أي خلايا سليمة تقريبا.

يمكن الحصول على نتائج مماثلة باستخدام إطلاق نازعة هيدروجين اللاكتات كعلامة على السمية الخلوية. مع اكتشاف نازعة هيدروجين اللاكتات لأول مرة بعد 18 ساعة من إضافة المادة الطافية السامة للخلايا وزيادة بطريقة خطية حتى يتم قياس الحد الأقصى لقتل الخلايا في 36 ساعة. يمكن أيضا تقييم المواد الطافية عن طريق تحليل اللطخة المناعية أو عن طريق قياس التغير في شدة مضان الثيوفلافين T بسبب التغيرات التأكيدية الناجمة عن ارتباط الأميلويد لتحديد وجود الأميلويد السامة للخلايا في المواد الطافية.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية توليد المواد الطافية السامة للخلايا بعد إصابة الخلايا البطانية ب citomonsis aeruginosa. بالإضافة إلى ذلك ، يجب أن تكون على دراية جيدة بأنواع المقايسات اللازمة لتمييز وتحليل السموم الخلوية الموجودة في تلك المواد الطافية