مغناطيسية تنشيط الخلية فرز الاستراتيجيات الرامية إلى عزل وتنقية الزليلي المستمدة من سائل الخلايا الجذعية الوسيطة من طراز الأرنب

يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في بروتوكول الفرز في مجال الخلايا الجذعية من خلال توفير إجراء لتنقية الخلايا الجذعية الوسيطة مباشرة من السائل الزليلي. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أننا أنشأنا بروتوكولا بسيطا واقتصاديا لعزل وتنقية MACS من السائل الزليلي للأرانب. بشكل عام في البحث ، بسبب هذه الطريقة ، نبذل جهودا كبيرة ، لأن تكاثر الخلايا يعتمد على إنتاج معلق خلية واحدة.

خطرت لنا فكرة هذه الطريقة لأول مرة عندما لاحظنا أن طريقة فرز الخلايا المنشطة مغناطيسيا فقط هي المعتمدة حاليا من قبل إدارة الغذاء والدواء الأمريكية للتطبيقات السريرية. ابدأ هذا الإجراء بالتخدير الحيواني كما هو موضح في البروتوكول النصي. لإجراء جمع السائل الزليلي المفصلي من ركبة الأرنب ، حدد مساحة يبلغ حجمها حوالي خمسة × خمسة سنتيمترات حول الركبة.

احلق شعر الأرانب من جميع أنحاء هذه المنطقة باستخدام ماكينة حلاقة كهربائية آمنة. بالتناوب ، قم بتطهير موقع الإجراء بمحلول اليود بوفيدون و 75٪ الإيثانول ثلاث مرات. ثم ضع ستائر معقمة بعد أن تجف المنطقة تماما.

استخدم حقنة معقمة تحت الجلد لحقن واحد إلى ملليلتر من محلول ملحي متساوي التوتر في تجويف مفصل الركبة من الفضاء المفصلي الجانبي. حرك الركبة ثلاث إلى أربع مرات ، ثم استنشق كل السائل الزليلي في درجة حرارة الغرفة. قم بتصفية السائل الزليلي من خلال مصفاة خلايا نايلون 40 ميكرون لإزالة أي حطام ، في غضون أربع ساعات.

لاستزراع الأرانب SF-MSCs ، اجمع السائل المصفى في أنابيب طرد مركزي سعة 50 مليلتر ، وأجهزة الطرد المركزي عند 1 ، 500 دورة في الدقيقة لمدة عشر دقائق في درجة حرارة الغرفة. تخلص من المادة الطافية بعد الطرد المركزي واغسل الحبيبات باستخدام PBS. بعد تعليق الحبيبات بوسط الاستزراع الكامل ، ضع الوسط في أطباق سعة 100 مل.

احتضان الأطباق عند 37 درجة مئوية في جو مرطب يحتوي على 5٪ ثاني أكسيد الكربون. بعد 48 ساعة ، قم بتجديد الأطباق بوسط طازج لإزالة أي خلايا غير ملتصقة. استبدل الوسيط مرتين في الأسبوع لمدة أسبوعين باعتباره ممر صفر.

بعد 14 يوما من الطلاء الأولي ، كان من المفترض أن تتشكل العديد من المستعمرات في أطباق الاستزراع. حدد المستعمرات التي يزيد قطرها عن ملليمترين. حدد مكان وجود المستعمرات المختارة ، من خلال تتبع محيطها في قاع الطبق.

تخلص من المستعمرات التي يقل عرضها عن ملليمترين باستخدام كاشطات الخلايا. قم بهضم المستعمرات المختارة بحوالي خمسة ميكرولترات من 0.25٪ تريبسين باستخدام أسطوانة استنساخ ، وانقل المستعمرات إلى طبق جديد للمرور. عندما تصل الخلايا إلى حوالي 80٪ من التقاء ، استنشق الوسط.

ثم أضف ملليلترا إلى ملليلترين من 0.25٪ تريبسين EDTA إلى كل طبق. احتضان الأطباق لمدة دقيقتين إلى ثلاث دقائق للسماح بانفصال الخلية. بمجرد فصل الخلايا ، أضف كمية متساوية من وسط المزرعة لتعطيل التربسين.

مرر تعليق الخلية من خلال مصفاة خلية 40 ميكرون واجمع المرشح في أنبوب سعة 15 مل. ثم قم بتدوير الخلايا عند 600 مرة G لمدة عشر دقائق في درجة حرارة الغرفة. قم بإعادة تعليق بيليه الخلية في MACS Running Buffer.

لإجراء الملصقات المغناطيسية ، حدد رقم الخلية باستخدام مقياس كثافة الدم. الطرد المركزي معلق الخلية عند 300 مرة G لمدة عشر دقائق عند أربع درجات مئوية. بعد شفط المادة الطافية بالكامل ، أضف 80 ميكرولترا من المخزن المؤقت لإعادة التعليق لكل عشرة ملايين خلية إجمالية.

لإجمالي عشرة ملايين خلية ، أضف 20 ميكرولترا من الميكروبيدات المترافقة مع جسم مضاد أحادي النسيلة مضاد للأرانب CD90. امزج الخرز المغناطيسي والخلايا بالتساوي في الأنابيب. ثم احتضنها عند أربع درجات مئوية لمدة 15 دقيقة في الظلام.

أضف مليلتر واحد من المخزن المؤقت لكل عشرة ملايين خلية إلى الأنبوب ، ثم جهاز الطرد المركزي عند 300 مرة G لمدة عشر دقائق عند أربع درجات مئوية ، لغسل الخلايا. تخلص من المادة الطافية بعد الطرد المركزي. أعد تعليق الحبيبات في 500 ميكرولتر من العازلة لكل عشرة ملايين خلية.

ضع العمود ، مع أجنحة العمود في المقدمة ، في المجال المغناطيسي للفاصل المغناطيسي. اشطف عمود الفاصل المغناطيسي ب 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت لكل عشرة ملايين خلية. انقل تعليق الخلية المفردة إلى العمود.

دع الخلايا السالبة تمر عبر المجال المغناطيسي للتخلص من هذه الخلايا غير المسماة. اغسل العمود مرة إلى مرتين باستخدام 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت لكل عشرة ملايين خلية ، وتخلص من التدفق من خلاله. انقل العمود إلى أنبوب طرد مركزي سعة 15 مل.

أضف ملليلتر واحد من المخزن المؤقت لكل عشرة ملايين خلية إلى العمود. ثم ادفع المكبس على الفور إلى العمود ، لطرد الخلايا المصنفة مغناطيسيا. كرر الإجراء المذكور أعلاه باستخدام عمود فاصل مغناطيسي ثان ، لزيادة نقاء الخلايا الإيجابية CD90 ، والتي يمكن أن تثري الجزء المغطى.

بعد الطرد المركزي لتعليق الخلية عند 300 مرة G لمدة عشر دقائق ، قم بشفط المادة الطافية ، وأعد تعليق الحبيبات بوسط الاستزراع. تلقيح الخلايا في أطباق 100 مل بعد فرز الخلايا المنشطة مغناطيسيا. احتضان الأطباق عند 37 درجة مئوية في حاضنة خلايا رطبة مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون.

عندما يتم تحقيق التقاء 80 إلى 90٪ من الثقافة الأولية ، في حوالي سبعة إلى عشرة أيام ، قم بهضم الخلايا الملتصقة باستخدام 0.25٪ تريبسين EDTA وقم بتمريرها عند تخفيف واحد إلى اثنين لجعل الممر الثاني. استخدم نفس الطريقة لتمرير الخلايا إلى المقطع الثالث ، والذي يمكن استخدامه في المقايسات في المختبر. كما هو موضح هنا ، هو مورفولوجيا الأرانب أحادية الطبقة SF-MSCs قبل وبعد MACS ، تحت المجهر المقلوب.

قبل الفرز ، تظهر مجموعات خلايا السائل الزليلي للأرانب الملتصقة عدم تجانس. تحتوي على أنواع وأحجام مختلفة من الخلايا مثل مورفولوجيا الشكل البيضاوي والمغزل الطويل والمغزل القصير والنجمي. التشكل الرئيسي للمقطع الثاني والمقطع السادس ، هو مورفولوجيا المغزل.

بعد MACS مع CD90 ، تظهر مجموعات الخلايا مورفولوجيا متجانسة. مع الثقافة الفرعية ، يزداد عدد الخلايا. أظهر تحليل قياس التدفق الخلوي أن خلايا SF-MSC للأرانب كانت إيجابية لعلامات MSC CD44 و CD105.

بينما تكون سلبية لعلامة الخلايا البطانية CD34 ، وعلامة الخلايا المكونة للدم CD45. أظهرت النتائج أنه قبل MACS ، كان عدد الأرانب SF-MSC يتألف من حوالي 40٪ من خلايا MSC. بعد MACS ، احتوى السكان المخصبون على أكثر من 99٪ من خلايا MSC.

كما هو موضح هنا ، هو تحليل قياس التدفق الخلوي لعلامة CD90 الإيجابية قبل وبعد فرز MAC. أظهر تلطيخ أليزارين الأحمر أن العقيدات المعدنية تشكلت تحت تحريض العظم لمدة ثلاثة أسابيع. بعد ثلاثة أسابيع من الحث الدهني ، تم الكشف عن تراكم الفجوات الغنية بالدهون عن طريق تلطيخ الزيت الأحمر داخل الخلايا.

بعد أسابيع شجرة من الحث الغضروفي ، تم فحص حبيبات الخلية من الناحية النسيجية باستخدام تلطيخ تولويدين الأزرق. يتميز البروتيوغليكان الحمضي الإيجابي بالخلايا الشبيهة بالخلايا الغضروفية. بعد ثلاثة أسابيع من الحث ، تم الكشف عن التعبير النسبي عن mRNA لعلامة بانيات العظم والعلامة الشحمية والعلامة الغضروفية.

بمجرد إتقانها ، يمكن القيام بهذه التقنية في غضون ساعتين إلى أربع ساعات. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد للعزلة المباشرة وتنقية الخلايا الجذعية الوسيطة من السائل الزليلي للأرانب الأبيض النيوزيلندي. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر تحديد تلك المستعمرات التي يزيد قطرها عن ملليلتر.

قم أيضا بإنتاج معلق خلية واحدة قبل الفرز المناعي المغناطيسي ، حيث ستبقى الخلايا غير المرغوب فيها المرتبطة بخلية مصنفة على الخرزة المغناطيسية. بعد هذا الإجراء ، يمكن إجراء طرق أخرى مثل فرز الخلايا المنشطة بالفلورة من أجل الإجابة على أسئلة إضافية تتناول سلامة وفعالية تنقية الخلايا الجذعية الوسيطة. بعد تطويرها ، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال تجديد الغضروف المفصلي لاستكشاف خلايا القرص المضغوط المثالية في إصلاح الغضروف المفصلي.

لا تنس أن العمليات تم إجراؤها على مقعد تبريد القوس ، ويجب دائما اتخاذ الاحتياطات مثل القفازات أثناء تنفيذ هذا الإجراء. تمتد الآثار المترتبة على هذه التقنية نحو علاج إصابة الغضروف المفصلي ، لأن السائل الزليلي المشتق من MASC مرشحون واعدون لتجديد الغضروف المفصلي.