تسلسل ميكرورنا أثر رجعي: الحمض النووي التكميلية المكتبة إعداد بروتوكول باستخدام عينات الفورمالين--الثابتة جزءا لا يتجزأ من البارافين الحمض النووي الريبي

الهدف العام من إعداد مكتبة CDNA هذا هو تمكين التسلسل الناجح للحمض النووي الريبي الصغير الذي تم تخزينه في أنسجة رسمية وثابتة مدمجة في البارافين. هذه الطريقة مفيدة جدا لتحليل العينات الرسمية والثابتة المضمنة في البارافين. تقوم باستخراج الحمض النووي الريبي من ما يصل إلى 18 عينة ، وتقوم بتحليل محتوى كل هذه الأشياء والحصول على ملف تعريف لجميع microRNase لجميع العينات.

لبدء البروتوكول ، أضف 8.5 ميكرولتر من مزيج الربط الرئيسي المعد مسبقا إلى كل من عينات FFPERNA ال 18 المقتبسة بشكل فردي. قم بنفض الغبار برفق عن الأنابيب وجهاز الطرد المركزي لمدة ثانيتين. بعد الطرد المركزي ، قم بتخزين الأنابيب على الجليد.

استخدم ماصة سعة ثلاثة ميكرولترات لنقل ميكرولتر واحد من كل محول إلى عينات FFPERNA المقابلة التي تحتوي على الحمض النووي الريبي ومزيج الربط الرئيسي. لا تقم بسحب الماصة لأعلى ولأسفل، وقم بتغيير الأطراف بين عينات FFPERNA. أغلق كل أنبوب ، وقم بنقره للخلط ، وقم بطرده المركزي لمدة ثانيتين.

ضع الأنابيب على الجليد. قم بتغيير طبيعة التفاعلات عن طريق وضع الأنابيب على كتلة حرارية عند 90 درجة مئوية لمدة دقيقة واحدة ، ثم وضعها على الفور على الجليد. بعد ذلك ، استخدم ماصة سعة ثلاثة ميكرولتر لنقل ميكرولتر واحد من إنزيم الربط المخفف إلى كل عينة من عينة الحمض النووي الريبي البالغ عددها 18.

ضع الأربطة على الثلج ، وضعها في غرفة باردة أربع درجات مئوية لمدة 18 ساعة طوال الليل. ضع الأنابيب على كتلة حرارية لمدة دقيقة واحدة عند 90 درجة مئوية لإلغاء تنشيط تفاعل الربط ثم أعدها إلى الجليد لمدة دقيقتين على الأقل لتبرد. انقل 1.2 ميكرولتر من مزيج هطول الأمطار الرئيسي إلى كل أنبوب.

أضف 63 ميكرولتر من الإيثانول بنسبة 100٪. أغلق كل أنبوب ، ونفض الغبار عن الأنابيب للخلط ، وقم بطردها لمدة ثانيتين. ضع الأنابيب على الجليد.

اجمع محتويات جميع الأنابيب ال 18 في أنبوب واحد من السيليكون سعة 1.5 مليلتر واقلبها ثلاث مرات للخلط. قم بالطرد المركزي للأنابيب لمدة ثانيتين ، وضعها على الجليد لمدة 60 دقيقة حتى تترسب. بعد هطول الأمطار ، قم بالطرد المركزي لأنبوب 1.5 مليلتر مع الأربطة المجمعة.

بعد ذلك ، قم بإزالة المادة الطافية بطرف ماصة سعة مليلتر واحد ولكن اترك بعض السوائل في الأسفل. قم بإمالة الأنبوب واستخدم ماصة سعة 20 ميكرولتر لإزالة المادة الطافية المتبقية. قم بشفط المادة الطافية بالمكنسة الكهربائية بماصة باستور بطرف 10 ميكرولتر ، ثم أعد تعليق حبيبات الحمض النووي الريبي في 20 ميكرولترا من الماء الخالي من RNase عن طريق النقر على الأنبوب.

أضف 20 ميكرولترا من محلول تحميل هلام PAA لإعادة تعليق الحمض النووي الريبي. قم بنقر الأنبوب ، وقم بالطرد المركزي للأنبوب لمدة ثانيتين في درجة حرارة الغرفة ، واضبط الأنبوب على الجليد. استبدل 0.5 XTBE المحضر مسبقا لجهاز الجل ب 0.5 XTBE طازج ، وقم بتحميل الأخير ، وعلامات الحجم ، و RNase المرتبط في وسط الجل ، مع ترك بئرين فارغين على كلا الجانبين.

ثم قم بتشغيل الجل. بعد تشغيل الجل ، قم بفك الصفحة بنسبة 15٪ عن طريق إزالة أحد الألواح الزجاجية. رش الجل الموجود على اللوحة الزجاجية برفق ب 10 ميكرولتر من محلول صبغة الفلورسنت و 25 مل من 0.5 XTBE ، واتركه مسطحا لمدة خمس دقائق في الظلام.

ضع الزجاج مع الجل على مصباح ضوئي أزرق ، وقم بمحاذاة كل من 19 علامة نيوكليوتيدات و 24 علامة بحجم النيوكليوتيدات مع مسطرة لتوجيه استئصال الحمض النووي الريبي الصغير المربوط. ثم استئصال الجل. ضع الجل المستأصل في أنبوب 0.5 مليلتر مصمم لتقطيع شرائح الهلام، في وضع آمن في أنبوب طرد مركزي دقيق من السيليكون سعة 1.5 مل.

الطرد المركزي الجل عند 16 ألف مرة G لمدة ثلاث دقائق في درجة حرارة الغرفة. أعد تعليق الجل المجزأ ب 300 ميكرولتر من محلول كلوريد الصوديوم 400 مللي مولار. أغلق الأنبوب وأغلقه بغشاء البارافين.

قم بتقليب المحتويات على الخلاط الحراري بسرعة 11 مائة دورة في الدقيقة في غرفة باردة بأربع درجات مئوية للحضانة طوال الليل. في اليوم التالي ، استرجع الأنبوب من الخلاط الحراري واستخدم ماصة سعة مليلتر واحد لنقل المحلول إلى أنبوب مرشح بسعة خمسة ميكرومتر ، يتم إدخاله في أنبوب تجميع خال من RNase سعة 1.5 ملليلتر. جهاز الطرد المركزي للأنبوب لمدة ثلاث دقائق عند 23 مائة مرة G في درجة حرارة الغرفة.

تخلص من أنبوب المرشح ، وأضف 950 ميكرولتر من الإيثانول بنسبة 100٪ إلى أنبوب التجميع الذي يحتوي على المحلول المصفى ، واقلب الأنبوب للخلط. قم بالطرد المركزي للأنبوب لمدة ثانيتين ، وضعه على الجليد لمدة 60 دقيقة. ثم قم بترسيب حبيبات الحمض النووي الريبي.

بعد ذلك ، جفف حبيبات الحمض النووي الريبي عن طريق فتح الغطاء وإزالة المادة الطافية بعناية باستخدام ماصة سعة مليلتر واحد ، مع ترك بعض السوائل في الأسفل. استخدم ماصة سعة 20 ميكرولتر لإزالة كل المادة الطافية المتبقية دون لمس الحبيبات. قم بإمالة الأنبوب بحيث ينتقل أي محلول متبقي إلى الجانب الآخر من الحبيبات.

استخدم ماصة باستور لشفط المادة الطافية وتجفيف الحبيبات باستخدام فراغ. أعد تعليق حبيبات الحمض النووي الريبي في 5.6 ميكرولتر من الماء الخالي من RNase. قم بإذابة كواشف النسخ العكسي على الجليد لمدة 15 دقيقة.

قم بإعداد تفاعل نسخ عكسي عن طريق إضافة ثلاثة ميكرولترات من المخزن المؤقت 5X ، و 4.2 ميكرولتر من ثلاثي فوسفات ثنائي النوكليوتيد 10X ، أو DNTPs ، و 1.5 ميكرولتر من dithiothreitol ، أو DTT. قم بنقر الأنبوب برفق لخلط التفاعل ، وجهاز الطرد المركزي لمدة ثانيتين لتجميع المحلول. بعد أن يكون التفاعل على كتلة حرارية عند 90 درجة مئوية لمدة 30 ثانية بالضبط ، انقله مباشرة إلى الخلاط الحراري عند 50 درجة مئوية لمدة دقيقتين لمعادلة درجة الحرارة.

أضف 0.75 ميكرولتر من إنزيم النسخ العكسي مباشرة في المحلول. انقر برفق للخلط ، ثم أعد الأنبوب إلى الخلاط الحراري على 50 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة على الفور. بعد 30 دقيقة ، انقل الأنبوب إلى كتلة حرارية عند 95 درجة مئوية لمدة دقيقة واحدة لإيقاف النسخ العكسي.

أضف 95 ميكرولترا من الماء الخالي من RNase مباشرة إلى النسخ العكسي. انقر فوق الأنبوب للخلط ، وضعه مباشرة على الثلج لمدة دقيقتين. قم بتجميع تفاعل PCR التجريبي وقم بإعداد دورتين PCR على المدورة الحرارية.

قم بإعداد تفاعل PCR التجريبي على جهاز التدوير الحراري وابدأ الملف الأول. في نهاية الملف الأول ، استخدم ماصة سعة 20 ميكرولتر لنقل 12 ميكرولترا من تفاعل PCR التجريبي إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 مليلتر يحتوي على ثلاثة ميكرولترات من صبغة تحميل الهلام 5X. امزج عن طريق سحب العينات لأعلى ولأسفل.

وقم بتسميته 10 دورات. أغلق أنبوب PCR التجريبي وابدأ الملف الثاني على المدورة الحرارية. في نهاية الملف الثاني ، استخدم ماصة سعة 20 ميكرولتر لنقل 12 ميكرولترا من المحلول إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 مليلتر مع ثلاثة ميكرولترات من صبغة تحميل الهلام 5X ، وقم بتسميتها 12 دورة.

كرر الخطوات المذكورة أعلاه لجمع 12 ميكرولترا من منتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل من تفاعل تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل التجريبي في دورات تفاعل البوليميراز المتسلسل 14 و 16 و 18 و 20. ثم أضف ثلاثة ميكرولترات من صبغة تحميل الجل 5X إلى كل من حصصات PCR سعة 12 ميكرولتر ، وإلى سلم 20 نيوكليوتيدات يحتوي على ثلاثة ميكرولترات من السلم وتسعة ميكرولترات من الماء الخالي من RNase. بعد تشغيل العينات على هلام الاغاروز مع 0.5 XTBE ، قم بتقييم الجل على صندوق الأشعة فوق البنفسجية لتحديد دورة تفاعل البوليميراز المتسلسل المثلى.

ثم قم بإعداد تفاعلات تفاعل البوليميراز المتسلسل واسعة النطاق لتنقية مكتبة هلام الاغاروز. بعد تضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل ، انقل تسعة ميكرولترات من كل أنبوب PCR إلى ستة أنابيب طرد مركزي دقيقة سعة 1.5 مليلتر ، تحتوي على ثلاثة ميكرولترات من صبغة تحميل الهلام 5X. تحضير سلم 20 نيوكليوتيد.

قم بتحميل السلم ، والتحكم السلبي في PCR ، وستة منتجات PCR على جل الاغاروز ، وقم بتشغيل الجل لمدة 30 دقيقة عند 120 فولت. تحقق من توحيد تضمينات تفاعل البوليميراز المتسلسل بين الممرات في صندوق الأشعة فوق البنفسجية ، والتقط صورة. اجمع بين ثلاثة تفاعلات تفاعل البوليميراز المتسلسل في أنبوبين من أجهزة الطرد المركزي الدقيقة من السيليكون سعة 1.5 ملليلتر ، وأضف 27 ميكرولترا من كلوريد الصوديوم الخمسة مولي ، و 950 ميكرولترا من الإيثانول بنسبة 100٪.

اقلب الأنابيب للخلط ، واضبطها على 20 درجة مئوية طوال الليل لترسيب منتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR). باستخدام البروتوكول ، تم التأكد من ارتباط تعبير الحمض النووي الريبي الصغير بين الحمض النووي الريبي للورم المجمد الجديد ونظرائهما في عينة FFPERNA المحددة. تشير المخططات بين الحمض النووي الريبي الصغير المجمد الطازج المتطابق و FFPE إلى أن إعداد مكتبة CDNA يوفر قابلية استنساخ جيدة ، حيث يوجد ارتباط كبير بين الحمض النووي الريبي الصغير المكتشف في العينات التي تتم معالجتها بشكل مختلف.

لتحديد ما إذا كان بروتوكول إعداد مكتبة CNDA المحسن قابلا للتطبيق وقابلا للتكرار مع عينات FFPE الأقدم بشكل متزايد ، تم الحصول على ملفات تعريف تعبير الحمض النووي الريبي الصغير من أنسجة FFPE المؤرشفة لمدة 18 و 20 و 22 و 27 و 30 و 35 عاما. ظل معامل الارتباط أعلى من 0.96 بغض النظر عن عمر العينة أو أسبوع إعداد المكتبة. لذلك ، يوفر بروتوكول إعداد مكتبة CDNA المحسن أداة قوية للتحليل القابل للتكرار لعينات FFPE ، بغض النظر عن وقت الأرشفة.

لذلك بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إعداد مكتبات الحمض النووي الريبي الصغيرة الخاصة بك والحصول على ملف تعريف دقيق كامل لجميع عيناتك الثمينة الرسمية والثابتة المضمنة في البارافين.