استخدام الأجسام المضادة-والرمات-جيردين لتصور الخلايا خصل المعوية في الماوس التعويم الحر صائم كريوسيكشنز

الهدف العام من إجراء التلوين هذا هو تصور خلايا الخصل في التشريح الجليدي الصائم للفأر. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال أمراض الجهاز الهضمي ، مثل كيفية تكاثر خلايا الخصل في أمعاء الثدييات أثناء الإصابة بالطفيليات. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أن الباحثين ذوي الخبرة النسيجية المحدودة يمكنهم الحصول على صور عالية الجودة لخلايا الخصل.

ابدأ بتعريض أعضاء الحوض لجثة فأر مثبتة حديثا بالفورمالين. قطع نهاية المستقيم من فتحة الشرج ، وفصل الأمعاء عن الجسم عن طريق قطع المساريق. لعزل الصائم ، قم بقطع الأمعاء أربعة سنتيمترات من الجانب الشرجي من antrum المعدة ، وتخلص من النصف الشرجي من الأمعاء الدقيقة المتبقية.

قص الصائم إلى نصفين لتسهيل عملية التنظيف. قم بتحميل 20 مل من محلول الفورمالين المحايد المخزن 10٪ في حقنة سعة 20 مليلتر ، وقم بتوصيل إبرة مستقيمة عيار 18 مع إزالة الشطبة. بعد ذلك ، قم بحقن محلول الفورمالين المحايد المخزن بنسبة 10٪ من أحد طرفي الصائم المقطوع لطرد محتويات الأمعاء ، ولإصلاح سطح تجويف الأمعاء.

اغسل تجويف الأمعاء عن طريق حقن PBS. ثم اغسل بمحلول الجيلاتين السائل لاستبدال PBS. أغلق أحد طرفي الصائم المقطوع عن طريق ربط الخياطة باستخدام خياطة مقطوعة من النايلون 6-0.

املأ الصائم بالجيلاتين السائل وأغلق الطرف الآخر عن طريق ربط الخياطة. بعد ذلك ، اربط أربع عقدة خياطة على طول الصائم. انقع الأنسجة في 50 مل من 15٪ سكروز في محلول فورمالين محايد مخزن 10٪ طوال الليل ، عند 4 درجات مئوية.

في اليوم التالي ، قم بقص الصائم عند عقد الخياطة للحصول على ثلاث قطع تشبه النقانق مع ربط كلا الطرفين. قم بمحاذاة القطع في قالب التبريد ، ثم قم بتغطيتها بمركب التضمين. قم بتجميد المبرد في الأيزوبنتان المبرد بالنيتروجين السائل.

لتحضير أقسام الصائم ، ابدأ بضبط درجة حرارة غرفة ناظم التبريد ودرجة حرارة الجسم على 22 درجة مئوية تحت الصفر. ضع كتلة الأنسجة المجمدة في حجرة ناظم التبريد لمدة 15 دقيقة على الأقل. بعد 15 دقيقة ، اقطع الكتلة إلى نصفين بشفرة حلاقة لفضح القسم العرضي من الصائم.

قم بتركيب نصف الكتلة على محول ناظم البرد. قسم الصائم المملوء بالجيلاتين إلى أقسام بسمك 30 ميكرون. استخدم ملقطا مجمدا لنقل الأقسام برفق إلى طبق استزراع 35 ملم يحتوي على 3 ملليلتر من PBS.

بعد غسل الأقسام ثلاث مرات لمدة خمس دقائق مع 3 ملليلتر من PBS-T ، أضف 3 ملليلتر من محلول استرجاع المستضد الطازج إلى الطبق الذي يحتوي على الأقسام العائمة بحرية. ثم أغلق الغطاء ، وأغلق الفجوة بين الطبق والغطاء بشريط من شريط الفينيل ، واحتضن عند 50 درجة مئوية في حاضنة تهجين لمدة ثلاث ساعات ، دون اهتزاز. بعد تلطيخ المناعة ، انقل طبق الأقسام الملطخة في PBS إلى مجهر مجسم.

ضع 200 ميكرولتر من PBS في قطرة في وسط شريحة زجاجية بيضاء مشفرة ب MAS. بعد ذلك، استخدم طرف ماصة P200 لنقل قسم صائم واحد من الطبق إلى القطرة. بعد ضبط محاذاة المقطع ، قم بشفط جميع البرامج المتبقية المحيطة بالقسم.

أضف 20 ميكرولترا من وسائط التركيب المائية ، وضع زلة غطاء فوق الوسائط. أغلق حواف انزلاق الغطاء على الفور بوسائط تثبيت قائمة على الزيلين ، واتركها تجف لمدة ساعتين إلى ثلاث ساعات قبل بدء الفحص المجهري متحد البؤر. حشوة الجيلاتين في الصائم تحافظ على شكل القرص المستدير وتحافظ على وضع مستقيم للزغب.

في حالة عدم وجود حشوة الجيلاتين ، تميل الأقسام الصائمية إلى الالتواء ، مما يسمح للزغابات بالتأرجح للخلف. يحدد pY1798 بشكل متكرر خلايا الخصل بأكملها ، بما في ذلك الغشاء ، والسيتوبلازما في سوما على شكل بكرة ، والطرف اللمعي الملطخ بقوة ، حيث يتوافق تكثيف الإشارة القوي مع الخصلة البارزة لخلية الخصل. يحتوي الفالودين على تقارب كبير مع الأكتين الخيطي ، الموجود في الزغابات الدقيقة التي تشكل حدود فرشاة الأمعاء.

الفالودين بشكل متكرر وبارز إلى حدود الفرشاة السميكة التي تتوافق مع كتلة من الجذور الممتدة من الخصل. يوضح التوطين المشترك المتسق لإشارات pY1798 مع حدود الفرشاة السميكة بشكل بارز والإيجابية للفالويد أن هذا البروتوكول يحدد بنجاح خلايا الخصل بغض النظر عما إذا كانت موجودة على زغابات أو في سرداب. بمجرد إتقانها ، يمكن القيام بهذه التقنية في غضون ثلاثة أيام إذا تم إجراؤها بشكل صحيح.

يمكن تطبيق مزيج من الجيلاتين ذو النقطة منخفضة الانبعاث ، والأقسام البردية العائمة بحرية ، واسترجاع المستضد بدرجة حرارة منخفضة لتلطيخ أنسجة المشروع الأخرى المناعية.