التحديد الكمي "النمو داخل الخلايا داخل الضامة" هو سريع وطريقة يمكن الاعتماد عليها لتقييم الفوعة طفيليات الليشمانيا

الهدف العام من هذه التجربة هو تقييم ضراوة سلالات الليشمانيا المختلفة من خلال إصابة الضامة المشتقة من نخاع عظم الفئران في المختبر ، والتقدير الكمي اللاحق لحركية نمو الطفيليات داخل الخلايا. يمكن أن تساعدنا هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية حول العوامل من كل من البلاعم للمضيف والممرض الذي يحدد ضراوة طفيليات الليشمانيا المعدية. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها طريقة سريعة واقتصادية وموثوقة تتطلب عددا أقل بكثير من ، مقارنة بالدراسات في الجسم الحي.

تمتد الآثار المترتبة على هذه التقنية إلى علاج داء الليشمانيات ، حيث يمكن استخدامه لتقييم عدوى سلالات الليشمانيا المتحولة ، أو فعالية المركبات العلاجية. يعد العرض المرئي لهذه الطريقة أمرا بالغ الأهمية ، حيث يصعب تعلم عزل البلاعم المشتق من نخاع العظام وخطوات القياس الكمي للطفيليات داخل الخلايا من البروتوكولات المكتوبة وحدها. ابدأ بتأمين أنثى فأرة عمرها من أربعة إلى ستة أسابيع على لوحة تشريح ، وتطهير بنسبة 70٪ من الإيثانول.

استخدم المقص لعمل شق بطول سنتيمتر واحد بالقرب من مفصل الورك وقطع الجلد على طول الطريق حول المفصل. اسحب الجلد من الساق باتجاه الكاحل لإزالة القفاز بعناية ، واقطع القدم عند أو أسفل مفصل الكاحل لترك الساق في لباقة. لتحديد موقع مفصل الورك ، قم بمعالجة عظم الفخذ لتحديد نقطة الدوران ، واستخدم المقص لقطع الساق فوق مفصل الورك ، تاركا الرأس القريب لعظم الفخذ في لباقة.

قم بإزالة أكبر قدر ممكن من العضلات والأنسجة الضامة من الساق ، ووضع العظام النظيفة في طبق بتري يحتوي على RPMI معقم مكمل بالمضادات الحيوية على الثلج. بعد حصاد المجموعة الثانية من عظام الساق ، استخدم ملقطا معقما وشفرة رقم عشرة لإزالة أي عضلات وأنسجة ضامة متبقية. انقل العظام النظيفة إلى غطاء طبق بتري فارغ ، واستخدم المشرط لإزالة طرفي كل ساق للوصول إلى النخاع.

باستخدام الملقط ، ضع حبة ساق واحدة فوق فم أنبوب مخروطي سعة 50 مليلتر على الجليد ، وأدخل طرف إبرة قياس 25 متصلة بحقنة سعة 10 مليلتر مملوءة بوسائط مكملة بالمضادات الحيوية في أحد طرفي الساق. اغسل ما يقرب من خمسة إلى 10 ملليلتر من الوسط عبر العظم في الأنبوب المخروطي حتى يتم حصاد كل أنسجة نخاع العظم الأحمر ويظهر العظم أبيض. عندما يتم جمع كل النخاع ، قم بالطرد المركزي لنخاع العظام المجمعة ، وأعد تعليق لوحة خلايا نخاع العظم في خمسة ملليلتر من وسط البلاعم المشتق من نخاع العظام.

انقل تعليق خلية نخاع العظم إلى قارورة ثقافة خلية مساحتها 175 سنتيمترا مربعا تحتوي على 60 مل من وسط البلاعم المعقم المشتق من نخاع العظام ، واشطف الأنبوب مرتين بوسط من قارورة الثقافة لضمان أقصى قدر من التعافي من الخلايا. بعد الغسيل الثاني ، انقل 30 مليلتر من الخلايا إلى قارورة ثانية لزراعة الخلايا تبلغ مساحتها 175 سم مربع ، وأغلق كل قارورة بغطاء مرشح. بعد ذلك ، احتضان كلتا المزرعتين بين عشية وضحاها عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون للسماح بفصل البلاعم المقيمة عن أي خلايا ليفية ملوثة أو خلايا ملتصقة أخرى.

في صباح اليوم التالي ، قم بنقل 10 ملليلتر من المادة الطافية غير المتمايزة المحتوية على نخاع العظم من كل قارورة إلى أطباق بتري البوليسترين غير المعالجة بزراعة الأنسجة 100 × 15 ملم ، وأعد الخلايا إلى حاضنة زراعة الخلايا لمدة يومين إلى ثلاثة أيام أخرى. بعد ذلك ، قم بتغذية الثقافات بخمسة ملليلتر من وسط البلاعم الطازج المشتق من نخاع العظام 37 درجة مئوية لكل طبق ، وأعد الأطباق إلى الحاضنة. في اليوم السابع أو الثامن بعد الزراعة ، استخدم طرف شفط مثبت على خط تفريغ لنقل أربعة زلات زجاجية معقمة بالأوتوكلاف مقاس 12 ملم إلى قاع كل بئر من لوحة ثقافة ستة آبار دون تداخل.

قم بإعداد لوحات متطابقة لكل نقطة زمنية من التجربة. بعد ذلك ، اغسل مزارع البلاعم المشتقة من نخاع العظام مرتين باستخدام 37 درجة مئوية PBS طازجة وخمسة ملليلتر من PBS بدون كالسيوم ومغنيسيوم مكمل ب EDTA واحد لكل طبق. بعد خمس دقائق عند 37 درجة مئوية ، قم بتجميع الخلايا المنفصلة في أنبوب مخروطي سعة 50 مليلتر ، واشطف كل طبق مرتين بخمسة ملليلتر إضافي من PBS بدون الكالسيوم والمغنيسيوم.

بعد الطرد المركزي ، أعد تعليق الضامة في خمسة إلى 10 ملليلتر من وسط البلاعم الطازج المشتق من نخاع العظام على الجليد. بعد العد ، قم بتخفيف الخلايا إلى خمسة مرات 10 إلى الخامس لكل تركيز لكل مليلتر في وسط البلاعم المشتق من نخاع العظام الطازج ، وأضف ملليلترين من الخلايا لكل بئر إلى لوحة الآبار الستة. ثم احتضان الخلايا طوال الليل في حاضنة زراعة الخلايا.

لإصابة الخلايا ب L.amazonesis ، قم بتخفيف معلق الطفيلي إلى التعدد التجريبي المناسب للعدوى ، وأضف 50 إلى 100 ميكرولتر من الطفيليات إلى كل بئر من جميع ألواح الآبار الستة ، بما في ذلك جميع النقاط الزمنية للتجربة. احتضان الضامة المشتقة من نخاع العظام لفترة العدوى ودرجة الحرارة المناسبة. بعد ذلك ، اغسل الآبار ثلاث مرات بملليلترين من 37 درجة مئوية PBS الطازجة بدون الكالسيوم أو المغنيسيوم لكل بئر ، وقم بإصلاح عينات النقطة الزمنية الأولية ب 1.5 إلى 2 مل من 2٪ بارافورمالدهايد لمدة 10 دقائق.

بالنسبة للألواح المقابلة للنقاط الزمنية اللاحقة ، أضف ملليلترين من وسط البلاعم الطازج المشتق من نخاع العظام إلى كل بئر ، وأعد الألواح إلى الحاضنة المناسبة. بعد ذلك ، قم بإصلاح وغسل الخلايا لكل نقطة زمنية متبقية ، كما هو موضح للتو ، وقم بتخزين العينات عند أربع درجات مئوية في PBS الجديد. لتلطيخ الخلايا ب DAPI ، استبدل المادة الطافية ب 1.5 مل من PBS الطازج بدون الكالسيوم والمغنيسيوم ، مع استكمال 0.1٪ منظف غير أيوني لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة ، متبوعا بثلاث غسلات ملليلتر مع PBS بدون الكالسيوم أو المغنيسيوم.

بعد ذلك ، قم بتلطيخ الخلايا بميكروغرامين لكل مليلتر من DAPI في مليلتر واحد من PBS لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. بعد ثلاث غسلات ، ضع جانب الخلية المنزلقة للغطاء لأسفل على شريحة مجهر زجاجي فردية مثبتة بكاشف تثبيت مضاد للبهتان تجاريا. بعد ذلك ، لتحديد عدد الخلايا المصابة ، استخدم هدف زيت الظهور 100x لمجهر مضان وعداد يدوي لتحديد عدد نوى amastigote الأصغر المتجمعة حول كل نواة كبيرة ملطخة ب DAPI.

ليشمانيا شكلان معديان ، البروماستيجوت الحلقي ، الذي يميز عن البروماستيجوت الحلقي في المرحلة الثابتة من الثقافة ، و amastigote ، الشكل المعدي داخل الخلايا الموجود داخل مضيف الفقاريات. هنا ، يمكن تصور الماساستيجوت المتمايزة محوريا داخل البلاعم المشتقة من نخاع العظام بعد ساعة واحدة من الإصابة الأولية وقبل تكوين الفجوات الطفيلية عن طريق الاندماج البلعمي. في غضون 48 ساعة ، يمكن ملاحظة فجوات طفيلية كبيرة مميزة تحتوي على طفيليات متعددة ، وهي سمة من سمات عدوى الليشمانيا الخبيثة.

النقيض من ذلك ، فإن promastigotes في مرحلة اللوغاريتمية غير الخبيثة غير قادرة على بدء تطور الفجوة الطفيلية ، وتفشل في التكاثر ، وتقتل في النهاية داخل الضامة المضيفة. في هذه التجربة ، لوحظت زيادة مطردة في عدد طفيليات الليشمانيا metacircle من النوع البري داخل الخلايا لمدة تصل إلى 72 ساعة بعد الإصابة ، بينما تم قياس نمو ضئيل أو معدوم داخل الخلايا للطفيليات الطافرة ذات الضعف في استيراد الحديد في الميتوكوندريا ، مما يشير إلى أن نشاط الميتوكوندريا مطلوب لنمو الطفيليات داخل الضامة. أظهرت عدوى البلاعم التي أجريت مع النوع البري والسماستيجوت المحوري الطافرة نمط نمو داخل الخلايا مشابه لذلك الذي لوحظ مع promastigotes metacyclic ، ولكن مع عدوى طفيلية من النوع البري أعلى مما شوهد من promastigotes metacircleic.

من المهم ملاحظة أن هناك تأخيرا أوليا لمدة 24 ساعة لعدوى promastigote metacyclic ، وهو ما يمثل الوقت اللازم للبروماستيجوت metacircle الداخلية للتمييز أولا إلى amastigotes قبل البدء في التكاثر. بمجرد إتقانها ، يمكن إكمال هذه التقنية في غضون 15 يوما إذا تم إجراؤها بشكل صحيح. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم استخدام سلالات الفئران المناسبة وإجراء قياس كمي دقيق لكل من خلايا البلاعم والطفيليات لضمان عمليات عمل متسقة عبر جميع التجارب.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية زراعة البلاعم المشتقة من نخاع العظام وإصابتها بالليشمانيا لتقدير نمو الطفيليات داخل الخلايا ، بعد التلوين النووي باستخدام DAPI. لا تنس أن العمل مع Leismania يمكن أن يكون خطيرا للغاية ، وأن الاحتياطات ، مثل استخدام خزانة السلامة البيولوجية ، ومعدات الحماية الشخصية ، وتجنب الأدوات الحادة يجب دائما اتخاذ أثناء تنفيذ هذا الإجراء.