Ecdysone المستندة إلى مستقبلات فريدة الجينات التبديل للتعبير المتعمد للتحوير مع المتانة وإمكانية الرجوع ويجتازها لا يعتد بها

الهدف العام من هذه التجربة هو تعديل التعبير الجيني المعدل عن طريق إعطاء المحفز الكيميائي تيبوفينوزيد. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال الخلية والبيولوجيا الجزيئية ، مثل عندما تحتاج إلى تحفيز التعبير عن جين مهم في الوقت المطلوب بالقوة المطلوبة. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنه من خلال الجمع بين جميع العناصر المطلوبة للتعبير عن الجينات المعدلة وراثيا داخل ناقل واحد ، يمكن تحفيز التعبير الجيني المعدل عن طريق إعطاء المحفز الكيميائي تيبوفينوزيد.

بعد الاستنساخ الفرعي للجينات المعدلة وراثيا EGFP أو ANKRD13A وفقا لبروتوكول النص ، قم بإعداد أربعة أطباق لزراعة الخلايا تحتوي على خلايا HEK 293 التي تم تمريرها حديثا في خمسة ملليلتر من DMEM مكملة بخمسة إلى 10٪ FBS والمضادات الحيوية ، والتي سيشار إليها فيما بعد باسم وسط الاستزراع. حافظ على الخلايا عند 37 درجة مئوية. عندما تصل الخلايا إلى 50 إلى 60٪ من الكثافة ، أضف ثلاثة ميكرولترات من كاشف التعدي إلى 200 ميكرولتر من المخفف الذي يحتوي على الحمض النووي.

بعد احتضان التفاعل في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة ، أضف الخليط إلى خلايا HEK 293. استخدم طبقين للتعداء ، واترك الطبقين الآخرين دون معالجة كضوابط. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية لمدة 12 إلى 24 ساعة.

بعد الحضانة ، أضف Teb إلى إحدى العينات المنقولة وإلى إحدى الضوابط غير المنقولة. اترك العينتين الأخريين دون معالجة كضوابط تجريبية. احتضن الأطباق لمدة 12 إلى 48 ساعة.

في حالة استخدام ملحق EGFP ، قم بتحليل تعبير EGFP تحت المجهر الفلوري. خلاف ذلك ، لحصاد الخلايا من أجل النشاف المناعي ، استخدم PBS المثلج لشطف الخلايا مرتين. بعد ذلك ، استخدم مكشطة خلية لإزالتها من اللوحة ، ونقلها إلى أنبوب مخروطي سعة 15 مل.

بعد ذلك ، قم بتدوير الأنابيب عند 21 ، 000 مرة جم و 18 إلى 25 درجة مئوية لمدة دقيقتين. ثم ، بعد التخلص من PBS ، أضف 0.5 مل من كاشف استخلاص بروتين الثدييات المثلج ، أو M-PER ، ومثبط البروتياز إلى الحبيبات. أعد تعليق الخلايا بعدة جولات من سحب العينات.

ثم احتضان معلق الخلية عند 18 إلى 25 درجة مئوية ودرجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة. قم بتدوير تحلل الخلية عند 21 ، 000 مرة جم وأربع درجات مئوية لمدة 10 دقائق. بعد ذلك ، قم بنقل المادة الطافية المائية إلى أنبوب طرد مركزي دقيق جديد سعة 1.5 مليلتر ، وقم بتحليله عن طريق النشاف المناعي بالأجسام المضادة المناسبة.

لإخماد محفزات Teb ، قم بإزالة وسط الثقافة المحتوي على Teb من الخلايا ، واستخدم PBS الدافئ مسبقا لشطف الخلايا مرتين. ثم أضف ملليلتر واحدا من 0.25٪ تريبسين / EDTA ، واحتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية لمدة دقيقة واحدة. أضف 10 مل من وسط الاستزراع المسخن مسبقا والخالي من Teb إلى الخلايا ، واستخدم مكشطة الخلايا لحصادها.

نقل الخلايا إلى أنبوب مخروطي سعة 15 ملليلترا. ثم قم بتدوير الخلايا عند 21 ، 000 مرة جم و 18 إلى 25 درجة مئوية لمدة دقيقتين. أعد تعليق الخلايا في 50 مل من وسط الاستزراع الدافئ مسبقا والخالي من Teb ، وانقل خمسة ملليلتر من الخلايا إلى ثلاثة أطباق زراعة الخلايا الطازجة مقاس 60 ملم.

احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية لمدة 24 و 48 و 72 ساعة على التوالي. أخيرا ، حصاد الخلايا في نقاط زمنية مختلفة ، وقياس مستويات التعبير عن الجين المعدل باستخدام النشاف المناعي. في هذه التجربة التي قيمت نشاط وتسرب pEUI-plus-EGFP ، لم تظهر أجهزة الإرسال والتوصيل الوهمية للناقل أي إشارة فلورية بغض النظر عن معالجة Teb.

ومع ذلك ، أصبحت أجهزة الإرسال pEUI-plus-EGFP حساسة تدريجيا للكمية المتزايدة من Teb. والأهم من ذلك ، أن أجهزة الإرسال والإرسال pEUI-plus-EGFP التي لم يتم معالجتها باستخدام Teb لم تصدر أي إشارات EGFP يمكن اكتشافها. تم استخدام ANKRD13A الموسومة بعلامة FLAG لمزيد من التحقق من استجابة pEUI-plus ل Teb.

كما هو موضح في هذه اللطخة الغربية باستخدام الأجسام المضادة المضادة ل FLAG ، أظهرت خلايا HEK 293 المنقولة تعبيرا قويا عن ANKRD13A بعد علاج لمدة 24 ساعة مع Teb. بالإضافة إلى ذلك ، أظهر استنفاد Teb قابلية انعكاس مفتاح الجينات pEUI-plus ، حيث لم يعد ANKRD13A قابلا للاكتشاف في الخلايا المزروعة بدون Teb. بمجرد إتقانها ، يمكن القيام بهذه التقنية في ساعة واحدة إذا تم إجراؤها بشكل صحيح.

أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر إجراء جميع التجارب تقريبا في ظل ظروف خالية من الجراثيم. باتباع هذا الإجراء ، يمكن تطبيق طرق أخرى ، مثل نظام Tet-On أو Tet-Off للتعبير تفاضلي عن جينين معدلين ومتميزين. بعد تطويرها ، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال بيولوجيا الخلية لاستكشاف علم وظائف الأعضاء الجزيئي على المستوى الخلوي.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية استخدام متجه تبديل الجينات pEUI-plus لغرض إحداث التعبير الجيني المعدل في الوقت المطلوب بالقوة المطلوبة. لا تنس أن العمل مع التيبوفينوزيد يمكن أن يكون خطيرا ويجب دائما اتخاذ الاحتياطات ، مثل ارتداء معطف المختبر ، أثناء تنفيذ هذا الإجراء.