استهداف الجين الطفرات العشوائية لتحديد طفرات بروتوزوم هيتيروتشروماتين-زعزعة الاستقرار في انشطار الخميرة

الهدف العام من هذا الطفرات العشوائية هو البحث عن الطفرات التي تزعزع استقرار الكروماتين المتغاير. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال الكروماتين المتغاير ، مثل العوامل التي تنظم تكوين والحفاظ على الكروماتين المتغاير. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها يمكن أن تستهدف على وجه التحديد الجين المطلوب للطفرات ، حتى لو كان الجين ضروريا.

للبدء ، قم بإعداد مستخلص الخميرة بالمكملات الغذائية ، أو نعم ، بدون الأدينين ، أو Pombe Glutamate Medium ، أو PMG ، و PMG بدون الأدينين ، عن طريق خلط المكونات كما هو موضح في هذا الجدول. بعد التعقيم وإضافة G418 إذا لزم الأمر ، حرك الوسط لمدة خمس إلى عشر دقائق أخرى. بعد ذلك ، قم بتقسيم الوسائط إلى أطباق بتري سعة 90 مليلتر وقم بتخزين الأطباق عند أربع درجات مئوية.

باستخدام rpt4 الإيجابي المستنسخ ، مع خمسة أولية وثلاثة UTRs الأولية وطفرة صامتة ، بالإضافة إلى البادئات p5 و p6 والبوليميراز الخاص ، المصمم لتوليد معدل خطأ مرتفع ، قم بإجراء تفاعل البوليميراز المتسلسل المعرض للخطأ في حجم إجمالي قدره 50 ميكرولترا. بعد إنشاء بنية التحويل والاندماج ، وفقا لبروتوكول النص ، قم بتلقيح عشرة ملليلتر من وسط YES بالخميرة ، واحتضانها لأكثر من 16 ساعة حتى التشبع. استخدم 200 مل من وسط YES لتخفيف الخلايا إلى OD600 من 0.2 ، واحتضان المزرعة عند 30 درجة مئوية مع الاهتزاز لمدة خمس إلى ست ساعات إلى OD600 من 0.6 إلى 0.8.

احسب حجم الخلايا التي تضيف ما يصل إلى OD600 من 30. بعد ذلك ، قم بتوزيع الخلايا في أربعة أنابيب مخروطية سعة 50 مليلتر وقم بتبريدها على الجليد لمدة 10 دقائق. حصاد الخلايا عن طريق الطرد المركزي عند 1050 جم وأربع درجات مئوية لمدة ثلاث دقائق.

بعد ذلك ، ضع أنابيب الطرد الدقيق مع الكاسيت DNA و 10 كوفيت كهربائي على الجليد. بينما لا تزال على الجليد ، تخلص من المادة الطافية وأضف 15 مل من السوربيتول 1.2 مولار ، وهز الأنابيب برفق لإعادة تعليق الخلايا ، ثم قم بالطرد المركزي للخلايا عند 1050 جم وأربع درجات مئوية لمدة ثلاث دقائق. تخلص من المادة المطفية وقم بغسل السوربيتول الثاني.

بعد الطرد المركزي ، تخلص من المادة الطافية. بعد ذلك ، أعد تعليق الخلايا وجمعها جميعا في أنبوب مخروطي واحد سعة 15 ملليلترا. بعد ذلك ، أضف 1.2 موربيتول مولار حتى 2.4 ملليلتر.

احتفظ بأنبوب الخلايا على الجليد. بعد ذلك ، أضف 200 ميكرولتر من الخلايا العالقة بالسوربيتول إلى أنبوب يحتوي على بنية تفاعل البوليميراز المتسلسل الانصهار ، واخلطها جيدا ، وانقل العينة إلى كوفيت كهربائي. من المهم عدم استخدام كمية زائدة من كاسيت PCR ، لأنها ستؤدي إلى أخطاء في التفريغ.

قم بتثقيب الخلايا بالكهرباء باستخدام الخيارات التالية:أضف 600 ميكرولتر من السوربيتول 1.2 مولار إلى كل كوفيت كهربائي لحجم إجمالي يبلغ 800 ميكرولتر. ثم انشر الخلايا على أربع لوحات نعم. احتضان الصفائح عند 30 درجة مئوية لمدة 24 ساعة.

بعد ذلك ، قم بإجراء طلاء طبق الأصل على YES بالإضافة إلى G418 قبل احتضان الألواح لمدة ثلاثة أيام إضافية. لكل لوحة YES plus G418 ، قم بإجراء طلاء طبق الأصل إلى YES بدون الأدينين و PMG بدون ألواح الأدينين. احتضان الألواح المقلدة عند 30 درجة مئوية لمدة يوم إلى يومين حتى تظهر بعض المستعمرات الموجودة على نعم بدون ألواح الأدينين لونا أبيض.

قارن نعم بدون الأدينين و PMG بدون ألواح الأدينين وحدد الخلايا التي تظهر اللون الوردي أو الأبيض على نعم بدون صفيحة الأدينين ، وتنمو أيضا على PMG بدون لوحة الأدينين. لا تختار مستعمرات بدون نمو على PMG بدون الأدينين ، لأنها إيجابيات خاطئة. اختر كل مستعمرة وأضفها إلى 10 ميكرولتر من محلول SPZ الذي يحتوي على 2.5 ملليغرام لكل مليلتر من زيموليز 100T.

ثم احتضان المستعمرات عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة على الأقل. بعد الحضانة ، استخدم ميكرولتر واحد من هذا المحلول كقالب بدء لمستعمرة PCR. بعد هضم مستعمرات مختارة وإجراء الرحلان الكهربائي للهلام وفقا لبروتوكول النص ، قم بتمييز المستعمرات التي تم قطع منتجات PCR الخاصة بها بواسطة XHO1 وتصحيحها إلى لوحات YES plus G418.

بعد عزل gDNA عن خلايا الخميرة الانشطارية ، وتسلسل منتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل وفقا لبروتوكول النص ، قارن التسلسل الذي تم الحصول عليه مع تسلسل النوع البري لتحديد الطفرات. بمجرد إعادة إدخال الطفرات في الخلايا البرية ، استخدم الإكتشاف لتأكيد النمط الظاهري في الخلايا الطافرة المكونة حديثا. يمكن تحليل طفرات rpt4 التي تم إنشاؤها باستخدام البروتوكول الموضح في هذا الفيديو من خلال تقييم ألوان المستعمرات.

كما هو موضح في هذا الشكل ، تم رصد المستعمرات على اللوحات ذات الصلة في تناقص عدد الخلايا. يتم إسكات مراسل الأدينين الذي يتم إدخاله في منطقة الكروماتين المتغاير في الخلايا البرية وينتج مستعمرات حمراء على نعم بدون ألواح الأدينين. بمجرد زعزعة استقرار الكروماتين غير المتجانس والتعبير عن مراسل الأدينين ، يمكن ملاحظة المستعمرات البيضاء على نعم بدون ألواح الأدينين كما هو موضح مع متحولة clr4-delta.

طفرات rpt4 التي تم فحصها كما هو موضح مع متحولة rpt4-1 تظهر أشد زعزعة استقرار الكروماتين غير المتجانس. بمجرد إتقانها ، يمكن القيام بهذه التقنية في غضون أسبوعين للحصول على الطفرات المرغوبة. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم التخلص من الإيجابيات الكاذبة لأنها أكثر تواترا مما كان متوقعا.

باتباع هذا الإجراء ، يمكن إجراء طرق أخرى مثل تنقية البروتين واختبارات نشاط الإنزيم من أجل الإجابة على أسئلة إضافية ، مثل طبيعة البروتينات. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية توليد طفرات في الجين المستهدف بالنمط الظاهري المطلوب.