السريع وخط أنابيب سهلة "توليد طفرات نقطة الجينوم" في C. ايليجانس باستخدام كريسبر/Cas9 "ريبونوكليوبروتينس"

الهدف العام من هذا الإجراء هو توليد طفرات نقطية جينومية في C.Elegans باستخدام قوالب الإصلاح الموجهة للتماثل قليل النوكليوتيدات أحادية السبل والبروتينات النووية الريبية CRISPR / Cas9. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال علم الأعصاب مثل تحديد العواقب المرضية للتباين الجيني المرتبط بمرض التنكس العصبي. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنه يمكن إنشاء طفرات النقطة الجينومية بسرعة مما يسمح بالدراسة الوظيفية للتباين الجيني في سياق التحكم التنظيمي السلطبي مع تجنب محاذير الإفراط في التعبير عن البروتين.

لإجراء تحديد هدف sgRNA ، افتح صفحة الويب الموضحة هنا. أدخل ما يقرب من 60 زوجا أساسيا من التسلسل يحيط بالتحرير المطلوب ذي الاهتمام. بعد تحديد جينوم C.Elegans والفكرة المجاورة للفاصل الأولي وفقا لبروتوكول النص ، انقر فوق إرسال.

في صفحة النتائج، اختر التسلسل المستهدف الأعلى ترتيبا الأقرب إلى التحرير محل الاهتمام. عند الاستلام ، قم بالطرد المركزي الأنبوب المحتوي على sgRNA المجفف بالتجميد في درجة حرارة الغرفة وما لا يقل عن 12 ، 000 جم لمدة دقيقة واحدة. أضف 60 ميكرولترا من TE الخالي من النوكلياز إلى الأنبوب واستخدم ماصة p200 لإعادة التعليق برفق عن طريق سحب العينات لأعلى ولأسفل من 15 إلى 20 مرة.

التركيز النهائي هو 50 ميكرومولار. صمم قالب ssODN HDR يحتوي على الطفرة ذات الأهمية ، وهو موقع نوكلياز داخلي فريد من نوعه لتقييد الإطار ، وطفرة صامتة لواحد أو كليهما من Gs ضمن تسلسل NGG PAM و 50 زوجا أساسيا من خمسة أذرع تماثل رئيسية وثلاثة أذرع تماثل رئيسية تحيط بالطفرة الأولى والأخيرة. عند الاستلام ، قم بالطرد المركزي للأنبوب المحتوي على ssODN المجفف بالتجميد كما هو موضح للتو ، ثم استخدم DD H20 الخالي من النوكلياز لإعادة تعليق ssODN برفق إلى تركيز نهائي يبلغ 100 ميكرومولار.

لتحضير مزيج الحقن ، قم بالطرد المركزي الكواشف الموضحة هنا بأقصى سرعة وأربع درجات مئوية لمدة دقيقتين. بالترتيب المذكور ، أضف الكواشف إلى أنبوب تفاعل البوليميراز المتسلسل الخالي من النوكلياز. ثم استخدم ماصة p20 لخلط المحتويات برفق وبدقة.

احتضان الأنبوب في درجة حرارة الغرفة لمدة عشر دقائق. بعد حقن P0 وفقا لبروتوكول النص ، اسمح لها بالتعافي في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة إلى ساعتين على صفيحة NGM مقاس 35 ملم OP50. بعد ذلك ، باستخدام دودة الأسلاك البلاتينية ، قم بنقل P0 أحادية الحقن إلى ألواح NGM الفردية OP50 المصنفة 35 ملم.

بعد يومين من الحقن ، استخدم مجهر فلوري لتحديد ألواح P0 التي تحتوي على ذرية F1 ، معبرا عن mCherry في البلعوم. اختر ثلاث لوحات P0 تحتوي على معظم F1 إيجابية mCheric. من كل لوحة من لوحات P0 الثلاثة المختارة ، استخدم معول دودة لفرد ثمانية إلى 12 محيوانات F1 موجبة الكرز ليصبح المجموع 24 إلى 36 م.

اسمح ل F1s الفردية بالتخصيب الذاتي ووضع البيض في درجة حرارة الغرفة لمدة يوم إلى يومين. بعد يوم إلى يومين من وضع البيض ، استخدم معول دودة لنقل F1s إلى أغطية أنبوب شريطية PCR فردية تحتوي على سبعة ميكرولترات من محلول تحلل الديدان. جهاز الطرد المركزي لأنابيب PCR بأقصى سرعة ودرجة حرارة الغرفة لمدة دقيقة واحدة لإحضار إلى قاع الأنبوب.

ثم قم بتجميد الأنابيب عند سالب 80 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة. بعد ذلك ، قم بتحلل الديدان المجمدة في جهاز تدوير حراري باستخدام البرنامج التالي. ثم قم بإعداد مزيج PCR الرئيسي كما هو موضح في هذا الجدول.

أضف 21 ميكرولترا من مزيج PCR الرئيسي إلى أنابيب PCR نظيفة ثم أضف أربعة ميكرولترات من أنبوب تحلل الدودة واخلطه جيدا عن طريق سحب العينات. ثم قم بتشغيل برنامج PCR باتباع إرشادات الشركة المصنعة. قم بتنقية تفاعلات تفاعل البوليميراز المتسلسل باستخدام مجموعة أدوات تنظيف وتركيز الحمض النووي باتباع تعليمات الشركة المصنعة.

ثم قم بتخفيف الحمض النووي عن طريق إضافة 10 ميكرولترات من الماء إلى عمود الدوران. بعد إعداد مزيج إنزيم التقييد الرئيسي ، أضف 10 ميكرولتر إلى كل تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل نظيفا واحتضان الأنابيب عند 37 درجة مئوية لمدة ساعة إلى ساعتين. ثم افصل منتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل المهضومة على هلام الاغاروز بنسبة 1.5٪ باستخدام 1x TAE buffer عند 120 فولت.

افحص العينات المهضومة بالإنزيم بحثا عن وجود نطاقات تشير إلى المعدلة المحتملة. بعد تحديد المحتملة المعدلة ، استخدم الميكرولترات الثلاثة المتبقية من تحلل الديدان وكرر تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR). ثم قم بتحميل التفاعلات المكتملة على الفور على هلام الاغاروز بنسبة 1٪ قبل فصل الشريط واستخراجه باستخدام مجموعة استخراج الجل.

باستخدام التمهيدي F1 ، قم بإجراء تسلسل Sanger لتحديد التي تم تحريرها بشكل صحيح. أخيرا للحصول على متماثلة اللواقح من معدلة متغايرة الزيجوت تم التحقق منها ، وواحد ثمانية إلى 12 F2 وإجراء التنميط الجيني والتحقق من التسلسل وفقا لبروتوكول النص. لإثبات بساطة وجدوى وكفاءة النهج القائم على CRISPR / Cas9 RNP ، تم استهداف جين C.Elegans sod-1 لإدخال متغير G93a البشري المرتبط بالمرض في جينوم الدودة.

تظهر صورة الجل هذه نتائج التنميط الجيني ل 24 mCherry إيجابية F1. 10 احتوت على تعديل أحادي أو ثنائي ، و 10 من النوع البري ، وثلاثة كانت indels محتملة ، وواحدة كانت فشل تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR). لإثبات أن علامة mCherry الفلورية تثري لتعديل الجينوم ، تم اختيار ثمانية سالبة mCherry من كل لوحة من لوحات P0 الثلاثة.

تم تعديل واحد فقط بشكل صحيح بينما كان 23 من النوع البري. يوضح هذا الشكل الكروماتوجرام من منتج تفاعل البوليميراز المتسلسل المستخرج من الهلام كامل الطول مما يدل على أن التغييرات الدقيقة في النيوكليوتيدات المصممة في قالب ssODN HDR قد تم دمجها بأمانة في جينوم هذا F1 متماثل اللواقح. بمجرد إتقانها ، يمكن استخدام هذه التقنية لتوليد وتحديد طفرات النقاط الجينومية في C.Elegans في غضون أربعة إلى خمسة أيام إذا تم إجراؤها بشكل صحيح.

أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر استخدام الكواشف والتقنيات الخالية من النواة بما في ذلك الماء الخالي من RNase وأطراف ماصة المرشح والقفازات. بعد هذا الإجراء ، يمكن إجراء فحوصات خلوية وجزيئية وسلوكية من أجل التحقيق في الأنماط الظاهرية التي قد ترتبط بطفرة الاهتمام. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إنشاء طفرات النقطة الجينومية بدقة في C.Elegans باستخدام البروتينات النووية الريبية ذات الدليل الفردي الخيمري RNase و CRISPR / Cas9.