تقييم الوكلاء الذي يحفز هايبربيرميبيليتي الأوعية الدموية في الجلد بمقايسة كم

الهدف العام من هذا الإجراء هو قياس تسرب الأوعية الدموية في أدمة الفأر الذي يحدث عن طريق الحقن داخل الأدمة لعوامل تعزيز النفاذية. يمكن أن يساعد هذا الإجراء في الإجابة على الأسئلة الرئيسية حول تنظيم نفاذية الأوعية الدموية في الجسم الحي مثل الجزيئات التي يمكن أن تحفز أو تمنع تسرب الأوعية الدموية وما هي مسارات الإشارات المعنية. الميزة الرئيسية لهذا الإجراء هي أنه سريع وبسيط نسبيا ويستخدم في الغالب كواشف ومواد معملية شائعة.

تمتد الآثار المترتبة على هذه التقنية إلى علاج الأمراض المصابة بالوذمة المرضية. على وجه الخصوص ، يمكن للباحثين استخدام هذا الاختبار لتحديد الأهداف الجزيئية الجديدة واختبار الأدوية ذات الصلة لقدرتها على تثبيط نفاذية الأوعية الدموية بطريقة سريعة وبسيطة نسبيا. تحضير محاليل منفصلة لمثبط الهيستامين بيريلامين ماليات وصبغة إيفانز الزرقاء كلاهما في محلول ملحي بنسبة 0.9٪.

ثم العمل في خزانة تدفق رقائقي ، وقم بتعقيم المحاليل عن طريق المرور عبر مرشح 0.22 ميكرومتر. قم بتحميل المحلين في محاقن منفصلة سعة ملليلتر واحدة مزودة بإبر قياس 30. بعد ذلك ، قم بتقطيع الماوس.

ثم قم بإمالة الماوس بحيث يتم توجيه الرأس نحو الأرض والبطن لأعلى. بعد وضع الفأر ، قم بإدارة 10 ميكرولتر لكل جرام من وزن الجسم من محلول بيريلامين ماليات عن طريق الحقن داخل الصفاق. بعد ذلك ، من أجل تعزيز توسع الأوعية ، ضع الماوس في غرفة حرارة عند 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.

ثم حرك الماوس إلى مصفاة الماوس. بعد ذلك ، افركي الذيل بنسبة 70٪ من الإيثانول لمزيد من توسع الأوعية. قم بإدارة 100 ميكرولتر من محلول Evans Blue Dye عن طريق الوريد من خلال الوريد الذيلي.

لمنع النزيف ، أمسك الذيل بسرعة بين الإصبع والإبهام واضغط في موقع الحقن. يعد الحقن الوريدي لصبغة إيفانز الزرقاء في وريد ذيل الفأر خطوة صعبة وحاسمة في هذا الإجراء. وفقا لذلك ، من الضروري أن يكون الباحثون مؤهلين في إجراء هذا الحقن قبل الشروع في بقية الإجراء.

سيتطلب إثبات الكفاءة ممارسة مسبقة. استخدم المحاليل المعقمة من محلول ملحي مخزن بالفوسفات لتخفيف كاشف VEGF بحيث يكون الحجم النهائي للجرعة 20 ميكرولترا. ثم قم بتحميل الكاشف المحفز لنفاذية VEGF والتحكم في السيارة في حقنتين منفصلتين سعة 300 ميكرولتر مزودة بإبر قياس 31.

حافظ على الإبرة بزاوية 15 درجة مع الجلد وحقن 20 ميكرولترا من VEGF داخل الجلد في جناح الفأر. حدد موقع فقاعة بارزة داخل الجلد للتحقق من صحة الحقن الناجح. إجراء الحقن داخل الأدمة في موقعين إضافيين على بعد سنتيمتر واحد على الأقل.

ثم أدر الماوس لكشف الجناح الثاني وكرر الحقن ثلاث مرات بمحلول السيارة. احتفظ بسجل لكل موقع من مواقع الحقن على الورق والوقت الذي يتم فيه إنهاء إجراء الحقن. ثم انقل الماوس إلى قفص المنزل.

استمر في مراقبة الفأر حتى يستعيد وعيه ويبدأ في التحرك حول القفص. دع محلول VEGF يعمل لمدة 20 دقيقة قبل استدعاء الماوس. في هذه المرحلة ، قم بحقن VEGFA والمركبة بالتتابع في جميع الفئران باتباع نفس الإجراء.

بعد 20 دقيقة ، ضع كل فأر تم القتل الرحيم على ظهره وقم بتثبيت قدميه على لوح من الفلين ملفوف بمنديل نظيف. بعد ذلك ، بمساعدة مقص حاد ، قم بعمل شق رأسي بطول ثلاثة إلى أربعة سنتيمترات من أسفل البطن إلى صدر الفأر الميت. ثم استخدم الملقط والمشرط لإثارة الجلد من جانبي الجناح.

استخدم المشرط لإزالة أي دهون إذا كانت موجودة في المناطق المحيطة بموقع التسرب. ثم استخدم الملقط والمشرط لاستئصال مناطق الجلد باستخدام صبغة إيفانز الزرقاء المتسربة. يجب أن تكون مناطق الجلد المستأصل متشابهة الحجم.

انقل عينات الجلد إلى أنابيب سعة 1.5 ملليلتر وقم بوضع ملصقات وفقا لذلك. جفف العينة عن طريق وضع الأنبوب المفتوح في كتلة حرارية طوال الليل. بعد اكتمال التجفيف ، أضف 250 ميكرولتر من الفورماميد منزوع الأيونات إلى العينة في غطاء الدخان.

أغلق غطاء الأنبوب وضعه في كتلة حرارية طوال الليل لاستخراج صبغة إيفانز. قم بالطرد المركزي للعينات عند 10،000 جم أو أعلى لمدة 40 دقيقة في جهاز طرد مركزي على الطاولة. بعد الطرد المركزي ، قم بنقل 100 ميكرولتر من كل مادة طافية تحتوي على صبغة من عينة الطرد المركزي إلى آبار صفيحة مكونة من 96 بئرا تعمل في غطاء الدخان.

اقرأ امتصاص إيفانز الأزرق باستخدام مقياس الطيف الضوئي. لدراسة تسرب الأوعية الدموية الناجم عن VEGF ، يتم حقن الفأر ب 50 نانوغراما من VEGFA في محلول ملحي مخزن بالفوسفات أو محلول ملحي مخزن بالفوسفات فقط كمركبة. تظهر الصورة زيادة في تراكم صبغة إيفانز الزرقاء المسربة في عينات الجلد المحقونة ب VEGFA مقارنة بالتحكم في السيارة في الموقع.

تظهر صورة اللوحة المكونة من 96 بئرا صبغة إيفانز الزرقاء المحملة المستخرجة في الفورماميد من عينة الجلد. يعرض هذا المخطط الرسومي قيم الامتصاص الطبيعية لعينات التحكم المقترنة VEGFA وعينات التحكم في السيارة فقط. تظهر المؤامرة أن حقن 50 نانوغراما من VEGFA يزيد بشكل كبير من تسرب Evans Dye مقارنة بالسيارة فقط.

يتم الحصول على هذا الرسم البياني بعد تحديد تغيرات الطي في الكثافة البصرية ل VEGFA مقابل عينات المركبات. تظهر المؤامرة زيادة متوسطة بمقدار ثلاثة أضعاف في تسرب الأوعية الدموية بعد إعطاء VEGFA مقارنة بالمركبة فقط. بمجرد إتقانها ، يمكن القيام بالجزء الرئيسي من هذه التقنية في غضون ساعتين إذا تم إجراؤها بشكل صحيح.

أثناء تنفيذ هذا الإجراء ، من المهم تطبيع تسرب الأوعية الدموية الناجم عن العامل لتسرب الأوعية الدموية الناجم عن السيارة لحساب تسرب الأوعية الدموية غير المحدد والاختلاف بين الفئران. يمكن دمج هذا الإجراء مع طرق أخرى مثل إعطاء الدواء من أجل الإجابة على أسئلة مثل ما إذا كان يمكن استهداف البروتين لتثبيط نفاذية الأوعية الدموية. بعد تطويرها ، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال بيولوجيا الأوعية الدموية لاستكشاف الآليات الجزيئية لفرط نفاذية الأوعية الدموية في الفئران المعدلة وراثيا لتحديد مكونات الإشارات الرئيسية المطلوبة لتسرب الأوعية الدموية.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تحفيز وقياس تسرب الأوعية الدموية في أدمة الفأر.