استخدام الموجات فوق الصوتية تسترشد الأنسجة الموجهة غرس الخلوية لإنشاء تكثيفها الورم المنتشر بيولوجيا ذات الصلة

الهدف من هذه الطريقة هو إنشاء طعوم تقويم العظام للسرطان ذات صلة بيولوجيا للدراسات قبل السريرية. يتم حقن خلايا الورم الأرومي العصبي المشتق من المريض في الغدة الكظرية الفئرانية عن طريق توجيه الموجات فوق الصوتية دون جراحة مفتوحة أو تعافي طويل. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الهامة في بيولوجيا السرطان وفي الأبحاث الانتقالية ، مثل دراسات تطور الورم ، والاستجابات العلاجية في البيئة المكروية الأصلية والنقائل.

مثل هذه المعرفة من شأنها أن تحسن بشكل كبير من موثوقية الدراسات قبل السريرية ويسهل اكتشاف الأدوية. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها مشتقة من المريض ، وموجهة من الأنسجة ، وفعالة ، وموثوقة في إنتاج نموذج تقويم العظام لأبحاث علاج السرطان. سيوضح ساهيتي تشوكابالي ، كبير الفنيين ومدير المختبر لدينا ، جنبا إلى جنب مع تينا توماس ، زميلة باحثة في مختبرنا.

قم بإنشاء معلق خلية سرطانية واحد مشتق من المريض من أنسجة الورم باستخدام مجموعة تفكك الورم. ابدأ بنقل ما يقرب من نصف جرام من أنسجة الورم إلى طبق ثقافة خلية 100 ملم يحتوي على خمسة ملليلتر من المخزن المؤقت RPMI المكممل بالإنزيم. بعد ذلك ، استخدم المقص والملقط الأنسجة لفرم الورم إلى قطع صغيرة من ملليمترين إلى أربعة ملليمترات.

قم بإخراج خليط الورم في أنبوب منفصل وأغلق الأنبوب. اقلب الأنبوب ، وقم بتثبيته على غلاف جهاز تقسيم الأنسجة ، وفصل الأنسجة باستخدام البرنامج المناسب. بعد الانفصال ، قم باحتضان تعليق الخلية السرطانية على رف دوار عند 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة.

ثلاثي تعليق الخلية كل 15 دقيقة أثناء الحضانة. بعد الحضانة ، انقل تعليق الخلية إلى أنبوب مخروطي جديد سعة 50 مليلتر وأضف 10 ملليلتر من RPMI. ثم ، قم بالطرد المركزي لتعليق الخلية عند 314 جم لمدة خمس دقائق.

بعد الطرد المركزي ، قم بإزالة المادة الطافية وتعليق الحبيبات في خمسة ملليلتر من RPMI. مرر معلق الخلية عبر مصفاة خلية 40 ميكرون واجمع المحلول المجهد في أنبوب جديد سعة 50 مل. بعد غسل المصفاة بخمسة ملليلتر من وسائط RPMI ، قم بالطرد المركزي لتعليق الخلية عند 314 جم لمدة خمس دقائق لجمع الحبيبات.

عد الخلايا باستخدام مقياس كثافة الدم. بعد ذلك ، قم بتعليق الحبيبات في RPMI للحصول على تركيز نهائي أربعة في 10 إلى خمس خلايا لكل حجم 10 ميكرولتر. انقل خمسة ميكرولترات من معلق الخلية هذا لكل حقنة إلى أنبوب جديد ، ونفس الحجم من مصفوفة الغشاء القاعدي لصنع 10 ميكرولتر من محلول الخلية لكل حقنة ووضعها على الجليد.

انقل الماوس إلى منصة التصوير مع وضع جانب البطن لأسفل. قم بتركيب مخروط الأنف وتثبيته للحفاظ على تخدير الأيزوفلوران. ابدأ عملية الزرع باستخدام غسول إزالة الشعر وماكينة حلاقة لإزالة ظهر وجناح فأر NSG مخدر بشكل صحيح يبلغ من العمر ستة إلى ثمانية أسابيع

ضع مرهما بصريا على عيون لمنع الجفاف. بعد ذلك ، قم بلصق الماوس في مكانه لمنع أي حركة غير مقصودة. بعد ذلك ، استخدم التصور بالموجات فوق الصوتية لتحديد كبد الفئران ، والوريد الأجوف ، والطحال ، والكلية اليسرى ، والغدة الكظرية اليسرى المجاورة.

قم بتحميل حقنة هاميلتون مبردة ، مزودة بإبرة تجويف صغيرة ، مع 10 ميكرولتر من محلول الخلية. بعد ذلك ، تحت إشراف الموجات فوق الصوتية ، أدخل قسطرة مبردة عيار 22 برفق عبر الجلد وعضلة الظهر ، مباشرة في الغدة الكظرية اليسرى لتوفير قناة للحقن الخلوي. قم بإزالة الإبرة واترك القسطرة في مكانها.

تصور الغدة الكظرية طوال إدخال القسطرة ، جنبا إلى جنب مع الإبرة ومسارها ، أمرا ضروريا لضمان الحد الأدنى من الإصابات للهياكل والأعضاء المحيطة وانخفاض مراضة الفئران. بعد ذلك، قم بتوجيه المحقنة عبر القسطرة الموضوعة في وسط الغدة الكظرية. عندما يتم توجيه المحقنة من خلال القسطرة ، من المهم الحفاظ على ثبات القسطرة ومراقبة تقدم الإبرة.

لاحظ أن الإبرة نفسها تمتد حوالي ملليمترين إلى ما بعد إنهاء القسطرة ، ويمكن رؤية موضعها بسهولة على الموجات فوق الصوتية. حقن الخلايا في أنسجة الغدة الكظرية المستهدفة. اترك الإبرة في مكانها لمدة دقيقة إلى دقيقتين للسماح لمصفوفة الغشاء القاعدي بالتماسك.

بعد تثبيت مصفوفة الغشاء القاعدي ، قم بإزالة الإبرة ببطء ، متبوعا بإزالة القسطرة. أخيرا ، ضع الفأر في قفص الاسترداد حتى يستعيد وعيه الكافي للحفاظ على الاستلقاء القصي قبل العودة إلى قفص المنزل. يراقب التصوير بالموجات فوق الصوتية تطور الورم في الجسم الحي.

تظهر هذه الصورة صورة بالموجات فوق الصوتية للغدة الكظرية، بعد أسبوع واحد من الحقن. هنا ، يظهر التصوير التلألؤ للورم الأرومي العصبي المحقون بالفأر بعد أسبوع واحد من الحقن ، قراءات لا تدل على نقش الورم. بعد أسبوعين ، يظهر التصوير بالموجات فوق الصوتية نقش الورم وتطوره إلى مساحة تبلغ حوالي 40 ملم مربع.

أظهر التلألؤ البيولوجي بعد أسبوعين من الحقن إشراقا بقياس 10 إلى السابع ، مما يشير إلى امتصاص الخلايا ونمو الورم المرتبط بنتائج الموجات فوق الصوتية. أظهر التصوير بالموجات فوق الصوتية بعد ثمانية أسابيع من الحقن نموا مستمرا للورم بقياس مساحة أكبر من 100 ملم مربع. مرة أخرى ، أكد التلألؤ البيولوجي نتائج الموجات فوق الصوتية مع زيادة مستويات الإشراق من 10 إلى تسعة.

أظهر التصوير بالموجات فوق الصوتية ثلاثية الأبعاد للورم حجما أكبر من 100 ملليمتر مكعب ، وهو خط الأساس الذي يستخدمه مختبرنا لبدء التجارب العلاجية قبل السريرية. تم قياس حجم الورم المستأصل بشكل كبير أكبر من سنتيمتر واحد ، ويرتبط بقياسات الموجات فوق الصوتية وإشارات اللمعان. تقدم هذه الوسائط عرضا توضيحيا لكيفية إنشاء زينوغرافيات تقويم العظام الكظرية بنجاح مع خلايا الورم الأرومي العصبي المشتق من المريض ، باستخدام إرشادات الموجات فوق الصوتية.

بمجرد إتقانها ، يمكن إجراء هذه التقنية في أقل من 12 دقيقة لكل حقنة إذا تم إجراؤها بشكل صحيح.