استكشاف ميكروبيومي الجذر: استخراج البيانات المجتمع البكتيرية من التربة، ورهيزوسفيري، واندوسفيري الجذر

الهدف العام من هذه التجربة هو توصيف ثلاث أقسام من ميكروبيوم الجذر ، والتربة ، والجذور ، والغلاف الداخلي للجذور ، باستخدام التنميط المجتمعي لجين الحمض النووي الريبي الريبوزومي 16S. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في علم البيئة الميكروبية ، مثل العوامل الحيوية واللاأحيائية التي تعد المحركات المهمة لبنية الميكروبيوم. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها توحد كل خطوة ، من فصل الجذر والجذور إلى استخراج الحمض النووي إلى إعداد مكتبة التسلسل.

سيظهر هذا الإجراء يوم الثلاثاء سيمونز ، طالب دراسات عليا في مختبر كولمان دير. لبدء البروتوكول ، اجمع عينات التربة السائبة باستخدام مجمع قلب التربة المعقم بالإيثانول للحصول على تربة خالية من جذور النباتات. اجمع نواة حوالي 23 إلى 30 سم من قاعدة النبات.

بعد ذلك ، انقل التربة إلى كيس بلاستيكي ، وقم بتجانس التربة عن طريق هز الكيس برفق ، وانقل 600 ملليغرام من عينة التربة إلى أنبوب واحد سعة ملليلتر ، ثم ضع على الفور أنبوب ملليلتر على الثلج الجاف حتى استخراج الحمض النووي. لجمع الجذر والجذر ، استخدم مجرفة معقمة بالإيثانول لحفر النبات ، مع الحرص على الحصول على أكبر قدر ممكن من الجذر. تخلص من التربة الزائدة برفق من الجذور حتى يلتصق بسطح الجذر بحوالي ملليمترين.

بالنسبة للنباتات الكبيرة ، استخدم مقصا معقما لقطع قسم فرعي تمثيلي من الجذور ، وضع ما لا يقل عن 500 ملليغرام من أنسجة الجذر في قارورة مخروطية سعة 50 ملليلترا. أضف ما يكفي من المخزن المؤقت لإزالة النباتات الهوائية لتغطية الجذور ، ثم ضع العينة على الفور على الثلج الجاف. لفصل الجذور عن الجذور ، قم بإذابة عينة الجذر على الجليد ، ثم صوتنة عينات الجذر.

انقل الجذور إلى أنبوب مبرد ونظيف سعة 50 مليلتر باستخدام ملقط معقم. لا تتخلص من الأنبوب الأصلي مع العازلة والتربة. يحتوي هذا على جزء الجذور.

بعد ذلك ، قم بالطرد المركزي للأنبوب الذي يحتوي على المخزن المؤقت والجذور. صب المادة الطافية ، ووضع جزء الجذور في الجليد الجاف. لغسل الجذور ، أضف ما يقرب من 20 مل من الماء المعقم أربع درجات مئوية إلى جزء الجذر.

اغسل الجذر عن طريق رجه بقوة لمدة 15 إلى 30 ثانية ، ثم صفي الماء. استخدم ملعقة معقمة لنقل 250 ملليغرام من التربة والجذور بسرعة إلى أنابيب تجميع منفصلة متوفرة في مجموعة عزل الحمض النووي التجارية لاستخراج التربة ، ثم تابع استخدام بروتوكول مورد المجموعة. بعد الشطف ، قم بتخزين الحمض النووي عند درجة حرارة 20 درجة مئوية تحت الصفر حتى يصبح جاهزا للمضي قدما في إعداد مكتبة amplicon ، ثم استخرج الحمض النووي من عينات الجذر.

قم بتبريد الملاط والمدقة المعقمة باستخدام النيتروجين السائل. قم بقياس 600 إلى 700 ملليغرام من أنسجة الجذر ، وضع الأنسجة في الهاون وأضف بعناية ما يكفي من النيتروجين السائل لتغطية الجذور. طحن الجذور إلى قطع صغيرة.

استمر في عملية إضافة النيتروجين السائل والطحن مرتين على الأقل ، مع الاتساق بين العينات ، حتى تصبح الجذور مسحوقا ناعما. بسرعة ، قبل أن يبدأ مسحوق الجذر في الذوبان ، استخدم ملعقة معقمة لنقل مسحوق الجذر إلى أنابيب 1.5 ملليلتر تزن مسبقا على الجليد. سجل وزن الأنبوب والمسحوق.

استخدم ملعقة معقمة لنقل 150 ملليغرام من مسحوق الجذر بسرعة إلى أنبوب التجميع المزود في مجموعة عزل الحمض النووي التجارية المصممة للاستخراج من التربة ، ثم تابع عزل الحمض النووي باستخدام بروتوكول مورد المجموعة. قم بإعداد مزيج رئيسي كاف من تفاعل البوليميراز المتسلسل لتضخيم كل عينة من الحمض النووي في ثلاث نسخ. صب المزيج الرئيسي في خزان ماصة معقم متعدد القنوات سعة 25 ملليلترا، ووزع 66 ميكرولترا من المزيج الرئيسي في كل بئر من لوحة PCR جديدة سعة 96 بئرا.

بعد ذلك ، أضف ستة ميكرولترات من خمسة نانوغرام لكل ميكرولتر من الحمض النووي من لوحة الحمض النووي الطبيعية إلى لوحة الخلط الرئيسية. بعد ذلك ، أضف إلى اللوحة الرئيسية 1.5 ميكرولتر من 10 ميكرومولار برايمر أمامي ، بحيث يحتوي كل عمود على رمز شريطي أمامي مختلف ، و 1.5 ميكرولتر من 10 ميكرومولار التمهيدي العكسي ، بحيث يحتوي كل صف على رمز شريطي عكسي مختلف. قم بتغطية اللوحة بفيلم ، وقم بتدوير اللوحة لفترة وجيزة عند 3 ، 000 RCF.

استخدم ماصة متعددة القنوات لخلط المحتويات برفق، ثم قسمها إلى ثلاثة ألواح تحتوي على 25 ميكرولترا من خليط التفاعل، وقم بتغطية الألواح بغشاء تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR). تضخيم الحمض النووي في كل لوحة باستخدام جهاز التدوير الحراري. بعد التضخيم ، قم بتجميع الألواح الثلاثة المكررة في لوحة واحدة مكونة من 96 بئرا.

باستخدام جدول بيانات الكمبيوتر ، احسب حجم 100 نانوجرام لكل عينة ، بالإضافة إلى متوسط الحجم لجميع العينات. لكل منتج PCR فارغ ، أضف متوسط الحجم المحسوب إلى أنبوب واحد سعة 1.5 ملليلتر. بالنسبة للعينات التي تم تضخيمها بنجاح ، قم بتجميع 100 نانوجرام من كل عينة في نفس الأنبوب ، ثم قم بقياس تركيز المنتج المجمع باستخدام مقياس الفلور على الطاولة ، وقم بمسح 600 نانوغرام من الحمض النووي في الماء الجزيئي إلى حجم نهائي قدره 100 ميكرولتر في أنبوب سعة 1.5 ملليلتر.

قم بتخزين المنتج المجمع المتبقي عند درجة حرارة 20 درجة مئوية تحت الصفر. قبل تنقية 600 نانوجرام من الحمض النووي ، قم بإعداد 600 ميكرولتر من الإيثانول الطازج بنسبة 70٪. اتبع عملية تنقية تفاعل البوليميراز المتسلسل المعمول بها باستخدام الخرز المغناطيسي.

هز أنبوب الخرز المغناطيسي لإعادة تعليق الخرزات التي تستقر في الأسفل. أضف 1x حجم ، 100 ميكرولتر ، من محلول الخرزة إلى 600 نانوغرام من الحمض النووي. امزج المحلول والخرز جيدا عن طريق سحب العينات 10 مرات.

بعد الخلط الشامل ، احتضن الخليط لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. ضع الأنبوب على الحامل المغناطيسي لمدة دقيقتين أو حتى يصبح المحلول صافيا لفصل الخرزات عن المحلول. احتفظ بالأنبوب في الحامل ، واستنشق المادة الطافية الشفافة بعناية دون لمس الخرز المغناطيسي ، وتخلص منها.

اترك الأنبوب في الحامل ، وأضف 300 ميكرولتر من 70٪ من الإيثانول إلى الأنبوب ، واحتضن الخرزات في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 ثانية. استنشق الإيثانول وتخلص منه. كرر هذه العملية ، وقم بإزالة كل الإيثانول بعد الغسيل الثاني.

قم بإزالة الأنبوب من الحامل المغناطيسي ، وجفف المحتويات بالهواء لمدة خمس دقائق. أضف 30 ميكرولترا من الماء الجزيئي إلى الخرز المجفف ، واخلطه عن طريق سحب العينات 10 مرات. احتضن في درجة حرارة الغرفة لمدة دقيقتين.

أعد الأنبوب إلى الحامل المغناطيسي لمدة دقيقة واحدة لفصل الخرز عن المحلول. انقل المصفاة إلى أنبوب جديد. قم بقياس التركيز النهائي للحمض النووي النظيف والمجمع باستخدام مقياس الفلور الذي يوضع على الطاولة.

تمييع كمية إلى 10 نانومولار في حجم نهائي قدره 30 ميكرولتر أو إلى التركيز والحجم المفضل من قبل مرفق التسلسل. بعد خطوة التضخيم ، تم إجراء التسلسل لتحديد تكوين المجتمع البكتيري لكل عينة. يجب ألا تكشف محاذاة تسلسل PNA مع كل جين RNA ريبوزومي 16S للميتوكوندريا لمضيف النبات الذي تم فحصه عن أي عدم تطابق.

يمكن أن يؤدي عدم تطابق واحد مع تسلسل PNA المكون من 13 زوجا أساسيا إلى تقليل الفعالية بشكل كبير ، كما في حالة تسلسل البلاستيدات الخضراء PNA المقدم وجين الحمض النووي الريبي الريبوزومي للبلاستيدات الخضراء 16S من Lactuca sativa ، أو الخس. نظرا لأنه تم تجميع كمية متساوية من الحمض النووي المضخم لكل عينة ، فقد تم الحصول على عدد زوجي من القراءات ، والتي تتطابق مع الأصناف البكتيرية ، لكل عينة بعد التسلسل ، وتم فرزها بناء على فهرسها المشفر. بمجرد إتقانها ، يمكن إجراء هذه التقنية لثمانية نباتات في ثماني ساعات تقريبا.

أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تكون متسقا بين التجارب. يمكن أن تؤدي التفاصيل الصغيرة مثل التغييرات في طريقة استخراج الحمض النووي ومزيج تفاعل البوليميراز المتسلسل الرئيسي إلى التحيز. باتباع هذا الإجراء ، يمكن استخدام طرق أخرى مثل metatranscriptomics للإجابة على أسئلة إضافية ، مثل الميكروبات النشطة ، وما هي الجينات التي تعبر عنها؟

لا تنس أن العمل باستخدام النيتروجين السائل يمكن أن يكون خطيرا للغاية ويجب دائما اتخاذ الاحتياطات مثل ارتداء معدات الوقاية الشخصية المناسبة أثناء تنفيذ هذا الإجراء.