كله جبل الفلورة وتقدير جريب المبايض الماوس مثقف

الهدف العام من هذا الإجراء هو الحصول على صور للمبايض الكاملة المزروعة المتوافقة مع القياس الكمي الآلي للجريب يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال البيولوجيا التناسلية مثل كيفية تداخل الحالات المختلفة مع لياقة المبيض. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها أقل كثافة في العمل وتحافظ على بنية الجهاز ثلاثية الأبعاد.

على الرغم من أن هذه الطريقة قد تم تحسينها لمبايض الفئران المستنبتة في اليوم الخامس بعد الولادة ، إلا أنه يمكن تطبيقها أيضا على الأعمار والأنسجة الأخرى مثل الغدد التناسلية الجنينية أو خصيتين الفئران الصغيرة. ابدأ بسطح عمل نظيف. امسحي المبيض بنسبة عشرة بالمائة واتركي المبيض على سطح منطقة العمل لمدة خمس دقائق على الأقل.

بعد خمس دقائق ، قم بإزالة المبيض الزائد باستخدام مناشف ورقية نظيفة و 70 في المائة من الإيثانول. نظف مجهر التشريح جيدا باستخدام 70 في المائة من الإيثانول وضع منشفة ورقية جافة على المسرح. لف الملقط والمقص النظيفين بمنشفة ورقية مبللة بنسبة 70 في المائة من الإيثانول.

ثم اصنع 50 مل من وسط زراعة المبيض في أنبوب مخروطي الشكل ودفئها في حمام مائي 37 درجة مئوية. بعد تسخين الوسط ، قم بإعداد الأطباق والإدخالات عن طريق إضافة مليلتر واحد من وسط زراعة المبيض أولا إلى ألواح زراعة الأنسجة 35 ملم. ثم أضف ما يقرب من 0.55 مل من الوسط إلى آبار صفيحة زراعة الأنسجة المكونة من 24 بئرا وضع إدخالا في كل بئر يحتوي على وسط.

تأكد من أن الأغشية تلامس الوسائط. ضع الألواح 35 ملم واللوحة الحاملة المكونة من 24 بئرا في حاضنة 37 درجة مئوية وخمسة بالمائة من ثاني أكسيد الكربون وحاضنة الأكسجين في الغلاف الجوي. ثم ضع لوحا ساخنا بجوار نطاق التشريح واضبط درجة الحرارة على 37 درجة مئوية.

إذا لم تكن حاضنة زراعة الأنسجة قريبة من منطقة التشريح ، فضع أحد أطباق زراعة الأنسجة مقاس 35 ملم التي تحتوي على وسائط زراعة المبيض على اللوحة الساخنة. ثم ابدأ التشريح عن طريق رش الأنثى القتل الرحيم حديثا بنسبة 70 في المائة من الإيثانول وضعها فوق المنشفة الورقية الجافة تحت مجهر التشريح. بعد إجراء شق في تجويف البطن ، قم بثق الأمعاء وتحديد موقع المبايض.

استخرج المبايض وضعها في وسط الاستزراع في طبق 35 ملم. بمجرد تشريح المبايض ، قم بزيادة تكبير مجهر التسلخ لتصور المبايض وأي أنسجة ملحقة بشكل أفضل. باستخدام ملقط نظيف ذو أطراف رفيعة ، قم بإزالة جميع الأنسجة غير المبيضية مثل الجراب والأنسجة الدهنية دون الإضرار بالمبايض.

بعد ذلك ، ضع كل زوج من المبايض على ملحق ثقافة خلية مبلل مسبقا واضبط حجم الوسط للتأكد من أنه كاف للحفاظ على رطوبة العضو دون غمره تماما. ضع الأعضاء المزروعة في حاضنة 37 درجة مئوية وخمسة بالمائة من ثاني أكسيد الكربون وحاضنة الأكسجين في الغلاف الجوي. في النقطة الزمنية التجريبية المطلوبة ، قم بإزالة وسط زراعة المبيض من اللوحة وقم بتثبيت المبايض المزروعة على الملحق عن طريق تغطية الأنسجة بمحلول PFA المعد حديثا بنسبة أربعة بالمائة.

أغلق حواف اللوحة بغشاء البارافين لتجنب التبخر وضع العينات عند أربع درجات مئوية طوال الليل. اشطف المنديل ثلاث مرات بنسبة 70 بالمائة من الإيثانول. ثم قم بتخزينها في قوارير تلألؤية مملوءة بنسبة 70 في المائة من الإيثانول عند أربع درجات مئوية حتى مزيد من المعالجة.

ابدأ في التلوين عن طريق إزالة 70 في المائة من الإيثانول من القوارير وغسل الأنسجة الثابتة باستخدام PBS في درجة حرارة الغرفة مع الرج لمدة أربع ساعات على الأقل. بعد إزالة PBS ، أضف محلول نفاذية كاف لغمر المبايض تماما. ضعها على شاكر مداري واحتضانها في درجة حرارة الغرفة لمدة أربع ساعات.

استبدل محلول النفاذية بمحلول مانع كاف لغمر المبايض تماما. ثم احتضان القوارير المختومة في درجة حرارة الغرفة لمدة لا تقل عن 12 ساعة على شاكر مداري. بعد الحظر ، ضع الإدخالات في صفيحة من 24 بئرا وأضف حوالي 750 ميكرولترا من محلول الأجسام المضادة الأولية لضمان غمر المبايض بالكامل.

ثم ضع اللوحة المختومة على شاكر المداري واحتضانها لمدة أربعة أيام في درجة حرارة الغرفة. بعد أربعة أيام ، قم بإزالة الجسم المضاد الأساسي وأضف كمية وفيرة من محلول الغسيل. اغسل المبايض طوال الليل.

في اليوم التالي ، استبدلها بمحلول غسيل طازج واحتضانها على الخلاط المداري لمدة ساعتين أو أكثر. بعد الغسيل ، أضف محلول الأجسام المضادة الثانوية. حماية العينات من الضوء واحتضانها على شاكر مداري في درجة حرارة الغرفة لمدة يومين.

بعد يومين ، قم بإزالة محلول الأجسام المضادة الثانوية من العينات وأضف محلول الغسيل. ابدأ بإعداد محلول المقاصة ScaleS0. امزج المحلول عن طريق الانعكاس واحتضانه على حرارة 50 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.

قم بإزالة الغاز من محلول المقاصة ScaleS0. ثم قم بإزالة محلول الغسيل من المبايض الملطخة بالمناعة. أضف محلول المقاصة.

قم بتغطية اللوحة بورق الألمنيوم وأعدها إلى شاكر المدار. من المهم للغاية التحلي بالصبر أثناء خطوات التلوين والتخلية. بمجرد أن تصبح الأنسجة شفافة ، استخدم مشرطا رفيعا لإزالة أغشية الإدخال التي تحتوي على المبايض المزروعة بعناية.

ضع العينة على شريحة زجاجية وقم بتغطية العينة برفق بغطاء غطاء. ثم انتقل إلى تصوير العينات على مجهر قادر على التقسيم البصري. تظهر هذه الصورة مبيضا في اليوم الخامس بعد الولادة لم يتم تطهيره.

هنا ، يظهر المبيض بعد ساعة واحدة من إضافة محلول المقاصة. سيبدأ المبيض في أن يصبح شفافا في غضون دقائق من غمره في محلول المقاصة. من الممكن التقسيم البصري للمبايض المزروعة دون تطهيرها ، لكن الخلايا العميقة داخل الأنسجة لديها إشارة يصعب التمييز بينها وبين الخلفية ، مما يعيق القياس الكمي المناسب للبويضات.

في المقابل ، تظهر هذه الصورة التمثيلية عينة تم تطهيرها حيث يمكن قياس كمية البويضة في جميع أنحاء العضو بأكمله. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر أن الأجسام المضادة يجب أن تنتشر عبر الأنسجة. وبالتالي ، فإن الأنسجة السميكة تتطلب وقتا أطول للحضانة. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية ثقافة المبايض الكاملة وتلطيخها وتصويرها.

يصف النص استخدام برنامج مجاني ، Fiji ImageJ ، يمكن استخدامه لقياس البصيلات البسيط. لا تنس أن العمل مع بارافورمالدهيد وأزيد الصوديوم يمكن أن يكون خطيرا ويجب دائما اتخاذ الاحتياطات مثل استخدام أغطية الدخان ومعدات الحماية الشخصية أثناء تنفيذ هذا الإجراء.