منصة موائع جزيئية أولتراهيغ الإنتاجية لتسلسل جينوم خلية واحدة

الهدف العام من هذه التجربة هو إنشاء بيانات تسلسل جيني مشفرة من عشرات الآلاف من الخلايا المفردة باستخدام سلسلة من أجهزة الموائع الدقيقة. تحقق هذه الطريقة إنتاجية تسلسل أحادية الخلية لا مثيل لها. نحن نستخدم الموائع الدقيقة لتغليف الخلايا وتحللها وترميزها بشكل فردي ، مع الحفاظ على عدم التجانس الجيني الأساسي ، والذي يضيع في الصدمة التقليدية في دراسات التسلسل.

الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها عالية الإنتاجية وقادرة على إنتاج بيانات أحادية الخلية من عشرات الآلاف من الخلايا. على الرغم من أننا نعمل مع الميكروبات في هذا العرض التوضيحي ، إلا أنه يمكن تكييف سير العمل للاستخدام مع أنواع الخلايا المختلفة من خلال تعديلات طفيفة على أبعاد جهاز الموائع الدقيقة. لبدء البروتوكول ، قم بإعداد مليلتر واحد من 3٪ من الوزن لكل حجم درجة حرارة انصهار منخفضة في 1X Tris-EDTA ، أو TE ، المخزن المؤقت.

احتفظ بمحلول الاغاروز على كتلة حرارية 90 درجة مئوية حتى تحميل المحقنة. أعد تعليق الخلايا في مليلتر واحد من محلول ملحي مخزن بالفوسفات ، أو PBS ، وقم بتدوير الخلايا. قم بشفط المادة الطافية ، وأعد تعليق حبيبات الخلية في مليلتر واحد من الحجم 17٪ إلى وسط تدرج كثافة الحجم في PBS ، واحتفظ بالخلايا على الجليد حتى تحميل المحقنة.

بعد ذلك ، قم بتحميل حقنة سعة ثلاثة ملليلتر بالزيت المفلور ، أو HFE ، تحتوي على 2٪ وزن لكل وزن PFPE-PEG خافض للتوتر السطحي. قم بتركيبه بإبرة قياس 27 ، وضعه في مضخة حقنة. قم بتحميل تعليق الخلية والأغاروز المنصهر في محاقن سعة مليلتر واحد ، وكلاهما يتناسب مع إبر قياس 27 ، ووضعها في مضخات الحقنة.

بعد ذلك ، اضبط سخان الفضاء على ارتفاع ، وضع سطح التسخين على بعد 10 سم من المحقنة. تأكد من أن درجة الحرارة المقاسة عند المحقنة تبلغ حوالي 80 درجة مئوية. قبل إدخال الأنابيب في الجهاز ، قم بتجهيز المضخات لإزالة الهواء من الخط.

قم بتوصيل إبر الحقنة بمداخل جهاز الموائع الدقيقة باستخدام قطع من البولي إيثيلين أو أنابيب البولي إيثيلين. قم بتوصيل قطعة من الأنبوب بالمخرج ، وضع الطرف الحر في أنبوب تجميع سعة 15 ملليلترا. بعد القطرة ، ضع أنبوب التجميع على أربع درجات مئوية لمدة 30 دقيقة لضمان التبلور الكامل للأغاروز.

قم بإزالة الطبقة السفلية من الزيت من أنبوب التجميع باستخدام حقنة سعة ثلاثة ملليلتر مزودة بإبرة قياس 20 ، مع الحرص على عدم إزعاج الطبقة العليا من قطرات الاغاروز. أضف مليلتر واحد من حجم 10٪ لكل حجم من PFO في HFE لكسر قطرات الاغاروز من طبقتها الخافضة للتوتر السطحي. ماصة المحلول لأعلى ولأسفل لمدة دقيقة واحدة لتغطية المستحلبات تماما ، والتي يجب أن تكون متجانسة وخالية من التكتلات.

قم بتدوير الأنبوب المخروطي في 2 ، 000 مرة جم لمدة دقيقة واحدة لجمع الهلاميات الدقيقة الاغاروز. استنشق المادة الطافية PFO / HFE ، وتأكد من أن الهلاميات الدقيقة خالية الآن من طبقتها الخافضة للتوتر السطحي ونظيفة. بعد غسل المواد الهلامية الدقيقة ، تحقق من تغليف الخلية في الخلايا الهلامية الدقيقة تحت المجهر بتكبير 400X عن طريق تلطيخ كمية 10 ميكرولتر من المواد الهلامية بصبغة الحمض النووي 1X.

قم بتوصيل مدخل الخلايا لجهاز dropmaker المشترك بقطعة صغيرة من لحام الرصاص. قبل إدخال الأنابيب في الجهاز ، قم بتجهيز المضخات لإزالة الهواء من الخط. قم بتوصيل قطعة من الأنبوب بالمخرج ، وضع الطرف الحر في أنبوب PCR سعة 0.2 ملليلتر.

استخدم معدلات التدفق على الشاشة لصنع السقوط. اجمع القطرات في أنابيب PCR مع ما يقرب من 50 ميكرولتر من القطرات في كل أنبوب. بعد القطرات، قم بإزالة الطبقة السفلية من زيت HFE بعناية من المستحلبات باستخدام أطراف ماصة تحميل الهلام، واستبدلها بزيت مفلور FC-40 يحتوي على 5٪ وزن لكل وزن PFPE-PEG خافض للتوتر السطحي.

ثم قم ببرمجة الدورة الحرارية. قبل إدخال الأنابيب في الجهاز ، قم بتجهيز المضخات لإزالة الهواء من الخط. قم بتوصيل المحاقن التي تحتوي على HFE ومزيج العلامات والمواد الهلامية الدقيقة بمداخل جهاز الموائع الدقيقة باستخدام قطع من أنابيب PE.

قم بتوصيل قطعة من الأنبوب بالمخرج ، وضع الطرف الحر في حقنة فارغة سعة مليلتر واحد مع سحب المكبس إلى خط المليلتر الواحد. بعد ذلك ، تحقق من معدل تغليف الميكروجيل تحت مجهر ضوئي بتكبير 400X. قم بتركيب المحقنة التي تحتوي على مستحلبات العلامات بإبرة ، واحتضانها في وضع مستقيم في كتلة حرارية أو فرن لمدة ساعة واحدة عند 55 درجة مئوية لتفتيت الحمض النووي الجيني.

قم بإعداد قطرات الباركود للاندماج عن طريق استبدال جزء زيت FC-40 بوزن HFE 2٪ لكل وزن PFPE-PEG. انقل القطرات بعناية إلى حقنة سعة مليلتر واحد ، وقم بتثبيتها بإبرة ، وضعها في مضخة حقنة. قم بتحميل حقنة قطرات الميكروهلام المحتضنة والموسومة في مضخة حقنة.

بعد ذلك ، قم بتوصيل محاقن كلوريد الصوديوم الثلاثة بمدخلي القطب ومدخل الخندق المائي الفردي باستخدام قطع من أنابيب PE. قبل إدخال الأنابيب في الجهاز ، قم بتجهيز المضخات لإزالة الهواء من الخط. قم بتوصيل المحاقن الثلاثة HFE المثبتة على المضخات بمدخلي الزيت المباعد ومدخل الزيت المتساقط باستخدام قطع من أنابيب البولي إيثيلين.

بعد ذلك ، قم بإطلاق النار على جميع أنابيب إعادة حقن القطرات بمسدس مضاد للكهرباء الساكنة قبل توصيل الأنبوب بإبر المحقنة. قم بتوصيل حقنة مزيج PCR ، وحقنة إسقاط microgel ، وحقنة إسقاط الباركود بمداخل كل منها باستخدام أنابيب PE. قم بتوصيل إبرة حقنة القطب الكهربائي بعاكس فلورسنت الكاثود البارد باستخدام مشبك التمساح.

اضبط مصدر طاقة التيار المستمر للعاكس على فولت. قم بتشغيل جهاز الدمج المزدوج بمعدلات التدفق الموصى بها. اجمع القطرات في أنابيب PCR مع ما يقرب من 50 ميكرولترا من المستحلب في كل أنبوب.

قبل التدوير الحراري، قم بإزالة الطبقة السفلية من زيت HFE بعناية من المستحلبات باستخدام أطراف ماصة تحميل الهلام، واستبدلها بزيت مفلور FC-40 يحتوي على 5٪ وزن لكل وزن PFPE-PEG للتوتر السطحي. ثم قم ببرمجة الدورة. لاستعادة الحمض النووي من قطرات الدورة الحرارية ، قم بتجميع القطرات في أنبوب طرد مركزي دقيق ، وكسر المستحلبات باستخدام 20 ميكرولترا من PFO.

دوامة لهم لمدة 10 ثوان لخلطها. قم بتدوير الأنبوب. قم بإزالة الطبقة المائية العليا بعناية من الأنبوب باستخدام ماصة ، وانقلها إلى أنبوب طرد مركزي دقيق جديد.

تجاهل مرحلة الزيت. بعد ذلك ، انتقل أخيرا إلى خطوات إعداد المكتبة وتسلسلها وتحليلها. يظهر الرسم البياني لعدد الباركود مقابل حجم المجموعة أن جزءا كبيرا من مجموعات الباركود الصالحة أعلى بقليل من أزواج القاعدة البالغة 7.5 كيلو أساس لكل حجم عتبة المجموعة ، مما يستثني الأيتام المتحولين ب PCR.

تم حساب الوفرة النسبية لأنواع الخلايا من مجتمع اصطناعي مكون من 10 خلايا من ثلاث بكتيريا سالبة الجرام وخمس بكتيريا موجبة الجرام وخميرة عن طريق حساب القراءات الأولية ومجموعات الباركود. توضح خريطة التغطية الدائرية ل B.subtilis التي تقرأ من جميع مجموعات الباركود توحيد قراءات SiC-seq ، مع عدم وجود مناطق تسرب يمكن ملاحظتها ، حيث كان متوسط التغطية 5.55X. تم التحقق من توحيد التغطية من خلال توزيع التردد لقيم التغطية المعيارية.

أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم الحفاظ على معدل تغليف يبلغ حوالي رمز شريطي أو خلية واحدة لكل 10 قطرات. هذا يحد من احتمالية حدوث حدث تغليف مزدوج ، والذي يمكن أن يؤدي إلى إلف بيانات الخلية الواحدة. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إعداد وتشغيل أجهزة الموائع الدقيقة المستخدمة لإنشاء بيانات تسلسل أحادية الخلية.

بمجرد إتقانها ، يمكن تشغيل هذه التقنية في ثماني ساعات أو يومين مدة كل منهما أربع ساعات.