الجينات المرشح الاختبار في الدراسات الفوجية السريرية مع التنميط متعدد والطيف الكتلي
يونيو 21, 2018
تحديد المتغيرات الجينية المساهمة في الأمراض البشرية المعقدة يسمح لنا بتحديد آليات جديدة. وهنا، علينا أن نظهر نهجاً متعدد الوراثي للجينات المرشحة أو تحليل مسار الجين الذي يزيد من تغطية تكلفة منخفضة وهي قابلة للدراسات الفوجية.
يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجالات التشخيص السريري وعلم الوراثة ، مثل الكشف عن العلامات الجينية المرتبطة بنتائج المرض ، بما في ذلك فيروس الورم الحليمي البشري. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها طريقة تشخيص فعالة من حيث التكلفة ومستهدفة وفعالة من حيث الوقت. لبدء هذا الإجراء ، أعد تكوين أي بادئات مجففة بالتجميد بالماء الجزيئي.
اسحب البادئات الأمامية والعكسية لكل اختبار متعدد الإرسال إلى مزيج أولي للمخزون ، بحيث يحتوي على كل مادة أولية بتركيز صفر نقطة خمسة مللي مولار. بعد ذلك ، قم بإعداد مزيج رئيسي ل PCR كما هو موضح في بروتوكول النص. أضف أربعة ميكرولترات من هذا المزيج إلى كل بئر من لوحة PCR المكونة من 384 بئرا ، جنبا إلى جنب مع ميكرولتر واحد من الحمض النووي الجيني بتركيز يتراوح بين خمسة و 10 نانوغرام لكل ميكرولتر.
قم بتغطية اللوحة بغطاء لوحة وجهاز طرد مركزي لمدة 200 مرة جم لمدة دقيقة واحدة في درجة حرارة الغرفة. ثم قم بتشغيل PCR كما هو موضح في بروتوكول النص. قم بتحميل ميكرولتر واحد من منتج PCR بثلاثة ميكرولتر من المخزن المؤقت للتحميل على جل الاغاروز 2٪.
قم بتشغيل 100 فولت لمدة 45 دقيقة للتأكد من نجاح تضخيم الحمض النووي. بعد ذلك، قم بإعداد مزيج SAP الرئيسي كما هو موضح في بروتوكول النص. أضف ميكرولترين من مزيج SAP الرئيسي الطازج إلى كل بئر من لوحة PCR التي تم تشغيلها مسبقا.
جهاز الطرد المركزي لفترة وجيزة عند 1 ، 000 مرة G لمدة دقيقة واحدة. ثم أعد اللوحة إلى الدراجة الحرارية. قم بتشغيل جهاز التدوير الحراري على حرارة 37 درجة مئوية لمدة 40 دقيقة.
ثم عند 85 درجة مئوية لمدة خمس دقائق لتعطيل الإنزيم. بعد حساب عامل التخفيف لكل برايمر ، اجمع بين الأحجام المحددة لكل منها لتكوين تجمع أولي. أضف الماء حسب الضرورة لتخفيف هذا البركة.
قم بتجميع مزيج الملحق الرئيسي إما لمقايسة الإلغاء العالي أو مقايسة plex المنخفضة، كما هو موضح في بروتوكول النص. أضف ميكرولترين من مزيج التمديد الرئيسي إلى كل بئر من اللوحة ، مما يجعل الحجم الإجمالي في كل بئر يصل إلى تسعة ميكرولترات. جهاز الطرد المركزي لفترة وجيزة عند 1 ، 000 مرة G لمدة دقيقة واحدة ، ثم أعد اللوحة إلى الدراجة الحرارية.
بعد ذلك ، أضف 16 ميكرولترا من الماء منزوع الأيونات إلى كل بئر ، ليصل الحجم الإجمالي إلى 25 ميكرولترا لكل بئر. ضع ستة ملليغرامات من الراتنج بالتساوي عبر لوحة راتنج الدمل بأكملها. دع الراتنج يجف لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
ثم ضع الراتنج على لوحة التفاعل. باستخدام خلاط التعليق ، قم بتدوير اللوحة بسرعة بطيئة لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك ، قم بالطرد المركزي للوحة عند 3 ، 200 مرة G لمدة خمس دقائق لتجنب تطبيق الراتنج على شريحة الأطياف الكتلية.
قم بتحميل تخطيط نموذج اللوحة إلى واجهة برنامج النظام. باستخدام نظام الاستغناء ، قم بتطبيق خليط تحليل التنميط الجيني من اللوحة إلى شريحة التنميط الجيني. قم بتحميل الشريحة في نظام MALDI-TOF لتوليد أطياف الكتلة من خليط التحليل ، وتفسيرها باستخدام واجهة برنامج النظام الأساسي.
في هذه الدراسة ، يتم إجراء التنميط الجيني متعدد الإرسال باستخدام قياس الطيف الكتلي. يتم إنشاء بيانات SNP التمثيلية وتحليلها للجين المرشح IL13 في مجموعة سريرية اكتشاف مظهرية لحساسية الطعام. يرتبط أحد المتغيرات ، rs1295686 ، بحساسية غذائية مثبتة في التحدي.
تم تأكيد هذا الارتباط في مجموعة النسخ المتماثل باستخدام نهج التنميط الجيني متعدد الإرسال الموضح في هذا البروتوكول. يوفر التحليل التلوي للنتائج من المجموعتين دليلا قويا على الارتباط بين IL13 و FA. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم عدم تلويث أي عينات أو كواشف. من المهم أيضا إعداد مزيج رئيسي إضافي بنسبة 10٪ لكل PCR لحساب أي خطأ في سحب العينات.
باتباع هذا الإجراء ، يمكن إجراء طرق أخرى مثل تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الفعلي من أجل الإجابة على أسئلة إضافية مثل ما إذا كان التعبير الجيني يرتبط بالعلامات الجينية المرتبطة بالمرض المحددة. بعد تطويرها ، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجالات التشخيص السريري وعلم الوراثة لاستكشاف ارتباطات المرض في مجموعات المرضى. لا تنس أنه عند العمل مع كواشف التنميط الجيني ونظام MALDI-TOF يمكن أن يكون خطيرا ، ويجب دائما اتخاذ الاحتياطات مثل ارتداء القفازات ومعطف المختبر عند تنفيذ هذا الإجراء.
اعرض النص الكامل واحصل على الوصول إلى آلاف الفيديوهات العلمية
نظرة عامة
تقدم هذه الدراسة منهجية للتنميط الجيني المتعدد لتحليل الجينات المرشحة المرتبطة بالأمراض البشرية المعقدة. وتتميز هذه الطريقة بفعاليتها من حيث التكلفة وملاءمتها للدراسات القائمة على المجموعات، مما يعزز من قدرة الكشف عن العلامات الجينية المرتبطة بنتائج المرض.
المكونات الرئيسية للدراسة
مجال العلوم
- علم الوراثة
- التشخيص السريري
- الكشف عن الممرضات
خلفية علمية
- يساعد تحديد المتغيرات الجينية في فهم آليات المرض.
- تعتبر الطرق ذات التكلفة الفعالة أمراً بالغ الأهمية للدراسات واسعة النطاق.
- يمكن للتنميط الجيني المتعدد تحسين كفاءة التشخيص.
- يعد فيروس الورم الحليمي البشري مثالاً على هدف للكشف عن العلامات الجينية.
الغرض من الدراسة
- تطوير طريقة تحديد نمط جيني متعدد لـتحليل الجينات المرشحة.
- زيادة نطاق التغطية إلى الحد الأقصى مع تقليل التكاليف.
- تسهيل الدراسات القائمة على المجموعات في علم الوراثة.
الطرق المستخدمة
- إعادة تشكيل البادئات المجففة بالتجميد باستخدام ماء بدرجة نقاء جزيئية.
- تحضير مزيج بادئات مخزني بتركيز 0.5 millimolar.
- تحضير المزيج الرئيسي (Master mix) لتفاعل PCR وفقاً للبروتوكول الموضح.
- استخدام لوح PCR يحتوي على 384 بئراً لتحليل DNA الجينومي.
النتائج الرئيسية
- أثبتت الطريقة كفاءتها في الكشف عن العلامات الجينية.
- تم التحقق من فعالية التكلفة من خلال التطبيق العملي.
- لوحظت كفاءة زمنية في عملية التشخيص.
- التطبيق الناجح في الكشف عن human papilloma virus.
الاستنتاجات
- يعد نهج التنميط الجيني المتعدد أداة قيمة في علم الوراثة.
- يوفر هذا النهج إطاراً للدراسات المستقبلية حول الأمراض المعقدة.
- يمكن أن تؤدي الأبحاث الإضافية إلى توسيع تطبيقاته في التشخيص السريري.
الأسئلة الشائعة
الأهمية الصناعية التنفيذية
يتيح التنميط الجيني المتعدد باستخدام مطيافية الكتلة تحليلاً عالي الإنتاجية وفعالاً من حيث التكلفة للمتغيرات الجينية في المجموعات السريرية، مما يدعم التحقق من الأهداف في أبحاث الأمراض المعقدة. ويعزز هذا النهج من الثقة التنبؤية من خلال ربط المواقع المرشحة مثل IL13 بالنتائج المظهرية مثل حساسية الطعام عبر دراسات ارتباط قوية إحصائياً. كما يضع الفحص الجيني كأداة اكتشاف قابلة للتوسع لتقليل المخاطر المرتبطة بالفرضيات العلاجية في مراحل البحث والتطوير المبكرة.
التطبيقات الاستراتيجية في البحث والتطوير في مجال الأدوية الحيوية
الاكتشاف المبكر والتحقق من الهدف
- القيمة العلمية: استقصاء الفرضيات العلاجية من خلال اختبار الارتباطات بين المتغيرات الجينية والأنماط الظاهرية للمرض في مجموعات دراسة ذات صلة سريرياً.
- القيمة التشغيلية: تتيح الاستقصاء المتزامن لما يصل إلى 40 من الـ SNPs في كل مقايسة، مما يزيد من الكفاءة في التحقق من صحة الأهداف على مستوى المسار.
- القيمة التنبؤية: تدعم تقليل المخاطر المتعلقة بـ IL13 كهدف علاجي من خلال تكرار وتحليل تجميعي لارتباطات النمط الجيني بالنمط الظاهري.
الفحص وتطوير المقايسة
- القيمة العلمية: يستخدم اختلال التوازن الارتباطي لتحقيق أقصى تغطية جينومية بأقل اختيار من تعدد أشكال النوكليوتيدات المفردة (SNP)، مما يحسن كفاءة تصميم المقايسة.
- القيمة التشغيلية: توفر قراءة MALDI-TOF بيانات تحديد أنماط جينية كمية وعالية الدقة مناسبة لمسارات التحليل الآلية.
- القابلية للتوسع: يتيح تنسيق PCR ذو 384 بئراً إنتاجية عالية للعينات من أجل حملات الفحص القائمة على المجموعات.
الأبحاث الانتقالية وما قبل السريرية
- الاستمرارية الترجمية: تربط النتائج الجينية في المجموعات البشرية بمسارات التحقق الوظيفي، مما يدعم اختيار الأهداف المتوافقة مع المؤشرات الحيوية.
- التقدم المعدل حسب المخاطر: يعزز التكرار في مجموعات مستقلة من الثقة للانتقال من مرحلة الاكتشاف إلى الاستثمار في الدراسات قبل السريرية.
- الرؤية الميكانيكية: تتيح إجراء دراسات متابعة (مثل ارتباط التعبير الجيني) لتوضيح الآليات البيولوجية الكامنة وراء الارتباطات الجينية.
تكامل مسار العمل وسير العمل
تندرج هذه الطريقة ضمن تسلسل عمليات الاكتشاف، بدءاً من الفرز الجيني وصولاً إلى تحديد المركبات الواعدة، حيث توفر مجموعات مصنفة جينياً من أجل التحقق من الأهداف في المراحل اللاحقة وفرز المركبات.
- بيولوجيا الاكتشاف: اختبار الفرضيات الجينية في مجموعات سريرية محددة النمط الظاهري لتوضيح المسارات المرتبطة بالمرض وتحديد أولويات الأهداف.
- الفحص: إنتاج بيانات نمط جيني موحدة وقابلة للتكرار تسمح بتصنيف العينات بشكل موثوق من أجل المقايسات الوظيفية.
- التحليلات: استخراج نتائج تحديد النمط الجيني عالية الثقة مع عتبات مراقبة الجودة، مما يدعم المقارنة الإحصائية عبر الحالات والمجموعات المختلفة.
- الأبحاث الانتقالية: ربط النتائج الجينية البشرية بالتحقق قبل السريري من خلال تحديد المتغيرات ذات الارتباط القوي بالنمط الظاهري.
- إعادة الاستخدام المؤسسي: يتميز تصميم المقايسة المتعددة بالقدرة على التكيف عبر الجينات والأمراض، مما يدعم الاستثمار على مستوى المنصة في البنية التحتية لتحديد الأنماط الجينية.
التأثير التشغيلي والمؤسسي
- القيمة العلمية: تزيد من الثقة في التحقق من الهدف من خلال الارتباطات الجينية المدعومة إحصائياً في المجموعات السكانية ذات الصلة سريرياً.
- القيمة التشغيلية: تقلل التكلفة لكل عينة عبر تعدد الإرسال (multiplexing) وتسهل سير العمل من خلال دمج تقنيات PCR، والامتداد (extension)، والكشف باستخدام MALDI-TOF.
- القيمة الاستراتيجية: تحسن قرارات المضي قدماً أو التوقف من خلال تقديم أدلة جينية بشرية تقلل من مخاطر اختيار الهدف في مرحلة مبكرة من مسار التطوير.
- التأثير على المحفظة: تتيح تحديد أولويات الأهداف بناءً على المخاطر المعدلة وفقاً للتكرار وحجم التأثير في دراسات المجموعات.
اعتبارات التنفيذ
- يتطلب خبرة في تصميم المقايسات الجينية، وتحسين تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR)، وتفسير بيانات MALDI-TOF.
- يعتمد على توفر أنظمة قياس الطيف الكتلي القادرة على إجراء التحاليل المتعددة (multiplex) وبرمجيات التنميط الجيني المعتمدة.
- يستلزم اتباع بروتوكولات موحدة لمناولة العينات ومراقبة الجودة (QC) لضمان تكرار النتائج عبر المواقع أو الدفعات المختلفة.
- يتطلب التكيف مع أهداف جديدة اختيار تعدد أشكال النوكليوتيدات المفردة (SNP) بناءً على عدم التوازن الارتباطي (LD) واختبار توافق البادئات في التحاليل المتعددة.
- تشمل القيود العملية الحساسية تجاه جودة الحمض النووي (DNA) في العينة، والحاجة إلى مناولة دقيقة للكواشف لتجنب التلوث.
