حقن ليبوبوليساكتشاريدي في الفئران لتقليد دخول المنتجات المستمدة من الجراثيم بعد خرق جدار الأمعاء

الهدف العام من هذه التجربة هو تقديم نموذج يحاكي دخول المنتجات المشتقة من الميكروبات بعد اختراق الحاجز المعوي. يمكن استخدام هذا النموذج للتحقيق في الاستجابات المناعية بعد غزو الكائنات الحية الدقيقة. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال مرض التهاب الأمعاء ، مثل الالتهاب غير المنضبط ، والذي يتميز بزيادة نفاذية ظهارة الأمعاء.

الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها لا تستخدم مضخة محددة فحسب ، بل هي أيضا نهج غير معقد لا يتطلب جراحة ويمكن استخدامه في كل بيئة معملية. سأعرض الإجراء أنا وراشيل ماكانينغو ، باحثة ما بعد الدكتوراه ، وبيرنا كايا ، طالبة دكتوراه. تعامل مع الماوس برفق ولكن بحزم ، وكبح جماح بيد واحدة.

تأكد من أن الماوس مثبت بإحكام ويمكنه التنفس بشكل طبيعي. قم بإمالة أنف الفأر قليلا نحو الأرض لكشف البطن للحقن. حدد موقع خط الوسط للبطن وحقن حجم LPS المطلوب على الجانب السفلي الأيسر أو الأيمن.

من المهم جدا التأكد من دخول الإبرة إلى التجويف البريتوني لتجنب الحقن الخاطئ. يجب ألا تتعمق الإبرة أيضا في التجويف البريتوني لتجنب إصابة الأعضاء الداخلية. أعد برفق إلى قفص المنزل.

مراقبة الفئران لحدوث وشدة التسمم الداخلي في وقت الحقن وكل ساعتين بعد ذلك لمدة ثماني ساعات. سجل الملاحظات في ورقة العلامات المرفقة. قم بإعداد أنابيب التجميع عن طريق إضافة مليلتر واحد من كاشف عزل الحمض النووي الريبي أحادي الخطوة إلى أنبوبين مليلتر مملوءين مسبقا بكرات خزفية 1.4 ملم.

بعد القتل الرحيم للفأر وتطبيقه ، استخدم مقصا لقطع الجلد وطبقة العضلات ، وتعريض تجويف البطن بالأعضاء الداخلية. قم بتشريح الطحال والكبد والقولون بعناية. نظف الدهون من كل عضو ، ثم ضعها في PBS على الثلج.

بعد ذلك ، استخدم مقصا أو مشرطا لقطع قطعة بطول 0.5 سم من كل عضو. جفف المنديل لفترة وجيزة على قطعة من المناديل الورقية ، وضعه في أنبوب التجميع ، وتأكد من غمره تماما في كاشف عزل الحمض النووي الريبي. ثم قم بتجانس الأنسجة في الخالط عالي السرعة.

بالنسبة للأنسجة الرخوة مثل الطحال والكبد والقولون ، استخدم دورة واحدة من التجانس بسرعة عالية لمدة 30 ثانية. بعد التجانس ، احتضان العينات لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. اغمر الأنابيب بعناية في النيتروجين السائل لالتقاط تجميد تحلل الأنسجة.

قم بتخزين المحللة المجمدة عند 80 درجة مئوية تحت الصفر حتى عزل الحمض النووي الريبي. ابدأ عزل الحمض النووي الريبي عن طريق إذابة تحلل الأنسجة المجمدة على الجليد. بمجرد إذابة الجليد ، قم بالطرد المركزي للعينة عند 1000 مرة G لمدة خمس دقائق عند أربع درجات مئوية لتكسير جزيئات الأنسجة المتبقية التي قد تكون متبقية.

بعد الطرد المركزي ، انقل المواد الطافية إلى أنبوب جديد خال من النوكلياز سعة 1.5 مليلتر ، وأضف 200 ميكرولتر من الكلوروفورم المثلج لكل مليلتر واحد من كاشف عزل الحمض النووي الريبي. رج العبوة على الفور لمدة 10 إلى 15 ثانية. بعد احتضان العينات لمدة دقيقتين إلى ثلاث دقائق في درجة حرارة الغرفة ، جهاز الطرد المركزي عند 12 ، 000 مرة G لمدة 15 دقيقة عند أربع درجات مئوية.

ستحتوي العينة الآن على ثلاث مراحل ، المرحلة الكلوروفورمية الفينول الأحمر السفلية ، والطور البيني ، والمرحلة المائية العلوية عديمة اللون. اجمع المرحلة المائية العلوية المحتوية على الحمض النووي الريبي وانقلها إلى أنبوب جديد خال من النوكلياز سعة 1.5 مل. لترسيب الحمض النووي الريبي ، أضف 0.5 مل من الأيزوبروبانول المثلج لكل مليلتر واحد من كاشف عزل الحمض النووي الريبي ، واخلطه برفق عن طريق قلب الأنبوب من خمس إلى ست مرات.

بعد الحضانة لمدة 10 إلى 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة ، جهاز الطرد المركزي عند 12 ، 000 مرة جم لمدة 10 دقائق عند أربع درجات مئوية. بعد الطرد المركزي ، قم بإزالة المادة الطافية التي تحتوي على الأيزوبروبانول تماما دون إزعاج الحبيبات. ثم اغسل الكريات بملليلتر واحد من الإيثانول المثلج 75٪ لكل مليلتر واحد من كاشف عزل الحمض النووي الريبي المستخدم في التحلل الأولي ، وقم بدوامة العينة لفترة وجيزة.

بعد الطرد المركزي للعينة عند 7500 أو 12 ، 000 مرة G لمدة خمس دقائق عند أربع درجات مئوية ، قم بإزالة المادة الطافية تماما دون إزعاج الحبيبات. اترك الأنابيب المفتوحة تحت الغطاء الكيميائي لمدة ثلاث إلى خمس دقائق لتجفيف حبيبات الحمض النووي الريبي في الهواء في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك ، قم بإذابة حبيبات الحمض النووي الريبي في 20 إلى 50 ميكرولتر من الماء الخالي من النوكلياز عن طريق سحب العينة بعناية لأعلى ولأسفل.

ثم احتضان العينة عند 55 درجة مئوية لمدة 10 إلى 15 دقيقة لتحسين محلول الحمض النووي الريبي. هضم الحمض النووي الملوث عن طريق إضافة الماء الخالي من النوكلياز أولا إلى 10 ميكروغرام كحد أقصى من الحمض النووي الريبي بحيث يكون الحجم النهائي 50 ميكرولترا بعد إضافة المخزن المؤقت والإنزيم. ثم أضف خمسة ميكرولترات من المخزن المؤقت 10X DNase 1 وميكرولتر واحد من DNase 1 المؤتلف لكل عينة واخلطها برفق عن طريق سحب العينة لأعلى ولأسفل.

احتضن عند 37 درجة مئوية لمدة 20 إلى 30 دقيقة. بعد الحضانة ، قم بدوامة DNase في كاشف التنشيط ، ثم أضف خمسة ميكرولترات إلى العينة واخلطها جيدا. احتضن لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة ، واخلطه يدويا من حين لآخر.

بعد الطرد المركزي عند 10 ، 000 مرة G لمدة دقيقة ونصف ، انقل المادة الطافية التي تحتوي على الحمض النووي الريبي الخالي من الحمض النووي إلى أنبوب جديد خال من النوكلياز. أخيرا ، قم بقياس تركيز الحمض النووي الريبي وجودته بواسطة مقياس الطيف الضوئي. بعد حقن LPS ، تم رسم درجة المرض ، والتي تتضمن تقييمات لمظهر ونشاطها ، وفتح عيونها ، ومعدل تنفسها وجودتها ، على المحور Y مقابل الوقت على المحور X.

كشف QPCR لتحديد تعبير السيتوكين أن Il6 بلغ ذروته بعد ساعتين من حقن LPS في الطحال والقولون ، وبعد أربع ساعات من الحقن في الكبد. بلغ التعبير عن Il1 beta و Tnf alpha و Il10 ذروته بعد أربع ساعات من الحقن في جميع الأنسجة. في غضون ثماني ساعات ، عاد التعبير عن Il6 و Il1 beta و Tnf alpha و Il10 إلى مستويات خط الأساس.

أثناء محاولة الإجراء ، من المهم أن تتذكر مراعاة جرعة LPS ، وحالة نظافة الفئران ، والنقطة الزمنية لإنهاء التجربة ، والأهم من ذلك ، الخلفية الجينية لسلالة الفأر. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تقليد دخول المركبات المشتقة من البكتيريا إلى المضيف بعد اختراق الحاجز. تؤدي الجرعة المنخفضة وشبه المميتة من LPS التي يتم حقنها بشكل منهجي في الفئران إلى زيادة تنظيم السيتوكينات المسببة للالتهابات ، والتي يتم قياسها كميا عن طريق تحليل RGQ PCR.