معالجات الجينوم الإدخال تسلسل إعداد مكتبة من عينة تارديجرادي واحد

الهدف من هذا البروتوكول هو تسلسل جينوم كائن مجهري يسمى بطيئات المشية. لقد أنشأنا طريقة لتسلسل جينوم بطيئات المشية ، Hypsibius dujardini ، من عينة واحدة بها 50 بيكوغراما من الحمض النووي الجيني مع تطبيق الجينوم الكامل. بعد عزل بطيئات المشية واحدة ، نقلل من التلوث البكتيري باستخدام المضادات الحيوية والفحص البصري.

لقد استخدمنا أيضا طريقتين للتجانس. أولا والأكثر استخداما في C.elegans باستخدام دورات التجميد والذوبان ، وثانيا ، التكسير اليدوي للبطيئات المشية بطرف ماصة. ثم يتم استخدام الحمض النووي لإنشاء مكتبة تسلسل ثم يتم تسلسله في أداة MiSeq.

ملخص شامل للبروتوكول. بعد عزل فرد واحد ، يخضع لثلاث دورات تجميد وذوبان للتجانس. يتم استخراج الحمض النووي الجيني وتنقيته ويتم تجزئته عن طريق الصوتنة.

ثم يتم إنشاء مكتبة تسلسل ، وبعد التحقق من صحة توزيع حجم المكتبة ، يتم تسلسلها باستخدام أداة التسلسل. تحضير 2٪ جل agarose باستخدام الماء المقطر كمذيب في طبق استزراع بلاستيكي 90 ملم ، و 10 ملليمترات من 1٪ بنسلين ستربتومايسين بالماء المقطر. يمكن تخزين الجل لمدة أسبوعين إلى ثلاثة أسابيع في حاضنة على حرارة 18 درجة.

اجمع بطيئات المشية واحدة وضعها على طبق أجار مجهز ، واغسله بالماء المقطر مرتين إلى ثلاث مرات لإزالة الجزيئات المتبقية. ضع المشية المفردة في المضادات الحيوية للبنسلين ستربتومايسين لمدة ساعتين إلى ست ساعات لإزالة التلوث البكتيري ، ووضع النظيف على زجاج منزلق نظيف باستخدام ماصة P10. راقب بطيئات المشية تحت المجهر بتكبير 500 مرة ، وتأكد من عدم وجود بكتيريا متبقية.

اجمع الفرد باستخدام ماصة P10 بحد أقصى خمسة ميكرولترات من السائل، وضعها في أنبوب تفاعل البوليميراز المتسلسل منخفض الارتباط، وقم بإزالة السوائل الزائدة قدر الإمكان. التجانس واستخراج الحمض النووي. تجانس للحصول على الحمض النووي الجيني بإحدى الطرق التالية.

التجانس مع دورات التجميد والذوبان. مباشرة بعد الخطوة 2.5 ، أضف 100 ميكرولتر من محلول التحلل إلى أنبوب تفاعل البوليميراز المتسلسل الذي يحتوي على بطيئات المشية. ضع أنبوب تفاعل البوليميراز المتسلسل في النيتروجين السائل لمدة 10 دقائق ، وانقله إلى كتلة حرارية ، دافئا إلى 37 درجة لمدة 10 دقائق.

كرر هذه الخطوة ثلاث مرات. التكسير اليدوي. تحت مجهر استريو ، سحق الفرد بطرف ماصة P10 عن طريق الضغط على على جدار أنبوب PCR ، وأضف على الفور 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتحلل.

احتضن لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة حتى يحدث التحلل. انقل الحجم الكامل لخليط التحلل إلى أنبوب دقيق نظيف منخفض الارتباط سعة 1.5 مل. أضف 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتحلل إلى أنبوب PCR منخفض الارتباط ، والذي يستخدم للتجانس وهو الآن فارغ.

وبعد سحب العينة ، انقل الخليط إلى 1.5 أنبوب دقيق منخفض الارتباط. كرر هذه الخطوة مرتين. أضف 300 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتحلل إلى أنبوب PCR منخفض الارتباط ، وبعد سحب العينات ، انقل الخليط إلى 1.5 مليلتر أنبوب دقيق منخفض الارتباط.

أضف إجمالي خليط التحلل 600 ميكرولتر إلى عمود الدوران الموجود في أنبوب التجميع ، وجهاز الطرد المركزي عند 10 ، 000 جم لمدة دقيقة واحدة. أعد تطبيق التدفق على العمود ، وجهاز الطرد المركزي عند 10 ، 000 جم لمدة دقيقة واحدة. هذه الخطوة ضرورية للتأكد من أن معظم الحمض النووي الجيني مرتبط بالعمود.

أضف 500 ميكرولتر من مخزن الغسيل المؤقت إلى عمود الدوران ، وجهاز الطرد المركزي عند 10،000 جم لمدة دقيقة واحدة. انقل عمود الدوران إلى أنبوب دقيق نظيف سعة 1.5 مل. ضع 20 ميكرولترا من الرباط الصليبي الأمامي الأول 10 مللي مولار على عمود الدوران وانتظر لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة.

جهاز طرد مركزي عند 10 ، 000 جم لمدة دقيقة واحدة. يجب ألا يحتوي المخزن المؤقت للتخفيف على EDTA ، لأنه يتداخل مع إنزيمات التحضير المختبري. أعد تطبيق التدفق على عمود الدوران ، وبعد خمس دقائق من الحضانة في درجة حرارة الغرفة ، جهاز الطرد المركزي لمدة دقيقة واحدة عند 10 ، 000 G. بناء مكتبة التسلسل.

تجزئة الحمض النووي. نقل 15 ميكرولترا من الحمض النووي الجيني إلى أنبوب دقيق سعة 15 ميكرولتر لتجزئة الحمض النووي ، وجهاز طرد مركزي لمدة دقيقة واحدة باستخدام جهاز طرد مركزي منضدي. قم بتقسيم الحمض النووي الجيني إلى 550 زوجا أساسيا.

بعد سحب العينات، انقل 10 ميكرولترات من خليط الحمض النووي المجزأ إلى أنبوب تفاعل البوليميراز المتسلسل النظيف منخفض الارتباط. يمكن إيقاف التجربة هنا. حافظ على الحمض النووي عند أربع أو 20 درجة تحت الصفر.

تسلسل بناء المكتبة. من الأهمية بمكان استخدام المجموعة المحددة في الإجراءات التالية ، بسبب انخفاض إدخال الحمض النووي. قم بإعداد الكواشف المطلوبة ، باتباع بروتوكول الشركة المصنعة ، وقم بإنشاء مكتبة التسلسل دون أي تعديلات.

بعد تطبيق خليط تضخيم المكتبة على خليط تخليق المكتبة ، قم بإجراء تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل في دورة حرارية. تم إجراء تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل كما هو موضح. تنقية تفاعل تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR).

أضف 50 ميكرولترا من الخرز المغناطيسي والماصة 10 مرات ، وقم بجهاز الطرد المركزي لفترة وجيزة باستخدام جهاز طرد مركزي صغير على الطاولة. احتضن لمدة دقيقتين في درجة حرارة الغرفة. احتضن على حامل مغناطيسي لمدة خمس دقائق ، أو حتى يصبح المحلول واضحا تماما ، وقم بإزالة المادة الطافية.

اتبع بروتوكول الشركة المصنعة. انقل المادة الطافية دون إزعاج الحبيبات إلى أنبوب تفاعل البوليميراز المتسلسل الجديد منخفض الارتباط. فحص جودة الحمض النووي وتحديده الكمي والتسلسل.

التحقق من صحة توزيع حجم مكتبة الحمض النووي. أضف ثلاثة ميكرولترات من عينة الماء مع ميكرولتر واحد من مكتبة التسلسل ، واخلطها جيدا لمدة دقيقة واحدة باستخدام دوامة ، ولفترة وجيزة جهاز طرد مركزي على الطرد المركزي. إجراء الرحلان الكهربائي والتحقق من صحة توزيع حجم المكتبة باستخدام البرامج المرتبطة.

وينبغي أن تتراوح ذروة الشظية الرئيسية على نطاق واسع من حوالي 300 إلى 000 1 زوج قاعدي. قياس الحمض النووي. أضف 796 ميكرولترا من المحلول المؤقت وأربعة ميكرولترات من كاشف التألق واخلطه جيدا.

قم بتوزيع 190 ميكرولترا من محلول العمل على أنبوبي فحص ، و 197 ميكرولترا في أنبوب فحص واحد. أضف 10 ميكرولترات من المعايير بتركيزات معروفة من الحمض النووي إلى كل أنبوب فحص يحتوي على 190 ميكرولتر من محلول العمل ، وثلاثة ميكرولترات من المكتبة المعدة لأنبوب الفحص الذي يحتوي على 197 ميكرولتر من محلول العمل. دوامة لفترة وجيزة ، وجهاز طرد مركزي على جهاز الطرد المركزي على الطاولة.

حدد كمية الحمض النووي باستخدام مقياس فلوري بثلاثة إعدادات ميكرولتر. تسلسل مكتبة الحمض النووي. قم بإعداد مكتبة التسلسل بناء على بروتوكول الشركة المصنعة.

قم بتعيين كاسيت الكاشف وخلية التدفق في أداة التسلسل، وأدخل معلومات تشغيل التسلسل، باتباع بروتوكول الشركة المصنعة. تشغيل التسلسل. النتائج الممثلة.

يظل التعرض للملوثات في استخراج الحمض النووي عالي الجودة هو النقطة الحاسمة في بروتوكولنا. لفحص ما إذا كانت ملوثة بصريا ، قمنا باحتضان المشية في المضادات الحيوية ، وهي البنسلين والستربتومايسين ، وفحصنا أيضا الفرد تحت المجهر 500 مرة. كما هو موضح هنا ، فإن الميكروبات المرئية حول بطيئات المشية مضاءة بالكامل.

بعد التجانس الفعال واستخراج الحمض النووي والتجزئة وإعداد المكتبة. يتم التحقق من توزيع حجم المكتبة باستخدام الرحلان الكهربائي عالي الحساسية لمراقبة الجودة. تشير الخطين الأرجواني والأخضر إلى العلامات العلوية والسفلية عند 1 و 500 و 25 زوجا أساسيا على التوالي.

الممر L عبارة عن علامة سلم ، والممر S و N1 إلى N4 عبارة عن خمس نسخ مكررة من نفس التجربة ، وكلها تبدأ من عينة واحدة بطيئات المشية. كما يمكن رؤيته من الزي الرسمي الواسع والتوزيع بين 200 و 1 ، 000 زوج أساسي ، فإن بروتوكولنا قابل للتكرار بدرجة كبيرة ، حتى مع المدخلات المنخفضة للغاية. فيما يلي نتيجة مراقبة الجودة السريعة، للقراءات المتزامنة التي تم الحصول عليها من تشغيل تسلسل واحد.

يتم الحصول على القراءات كنهايات احتياطية ل 300 زوج أساسي ، حيث تظهر القراءات الأمامية والخلفية في الأعلى والأسفل ، على التوالي. التوزيع الموضح هنا نموذجي ل 300 قراءة نهاية زوج ، مع قاعدة عالية الجودة تستدعي أعلى من Q30 لأول 200 زوج أساسي ، وتنخفض تدريجيا حتى النهاية. لذلك تستخدم هذه الطريقة فردا واحدا فقط لعينة واحدة.

لا توجد متطلبات لكميات هائلة من ، مثل تلك المطلوبة في مشاريع تسلسل جينوم بطيئات المشية السابقة. لم يتم بعد إنشاء طرق الاستزراع لمعظم بطيئات المشية. لذلك ، فإن تمكين تسلسل الجينوم من فرد واحد ، مثل تلك الموجودة مباشرة من العمل الميداني ، سيكون له تأثير كبير على البيولوجيا الجزيئية بطيئات المشية ، وربما على الصغيرة الأخرى.

طرق تسلسل الحمض النووي الخاصة بنا تحليل الكائنات الحية المجهرية العديدة الأخرى التي لم يتم تسلسلها بعد ، مثل أنواع عشبة الهوجوجي النادرة ، والديدان الخيطية ، والتنوب المائي ، وخيارات أخرى ، من خلال ربط جزء من المناطق ومنطقة عامة أوسع ، مما يعزز الإعداد الذي قد تكون فيه الآليات البيولوجية المختلفة ممكنة.