بروتوكول لاكتساب تينوسيتي التنكسية من البشر

يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية حول بيولوجيا خلايا الوتر التنكسية البشرية حيث وصفت دراسات قليلة فقط عزل الخلايا التنكسية البشرية وثقافتها بالتفصيل. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنه يمكننا الحصول على غمد التنسي البشري دون إصابة إضافية للمريض لأن الأنسجة التنكسية يتم اكتسابها أثناء جراحة التهاب اللقيمة القياسية. سيظهر الإجراء الدكتور سو هونغ هان ومينجونج بايك وهيونج كيونغ كيم من المستوى الثالث.

للحصول على عينة من أنسجة الخلايا الوترية التنكسية ، استخدم مشرط جراحي رقم 15 لعمل شق جلدي من ثلاثة إلى خمسة سنتيمترات فقط في الجزء الأمامي الإنسي لللقيمة الجانبية ، وقريب من مستوى المفصل لفضح الكوع الجانبي وتحديد موقع الباسطة carpi radialis longus بصريا في واجهة السكتة الدماغية الباسطة. استخدم المشرط لعمل شق انقسام بعمق من ملليمترين إلى ثلاثة ملليمترات بين الباسطة carpi radialis longus و aponeurosis الباسطة في الواجهة. بعد التراجع الأمامي للباسط carpi radialis longus ، حدد موقع الأنسجة التنكسية المرضية من خلال لونه الرمادي الباهت المميز والأنسجة الوذمية والوذمية والقابلة للتفتيت ، واستخدم المشرط والشفرات الصغيرة لاستئصال جميع الأنسجة التنكسية بعناية ، ولكن بشكل حاد.

عندما يتم حصاد كل الأنسجة ، أغلق الجرح بمادة خياطة غير قابلة للامتصاص وفقا للبروتوكولات القياسية وقم بإزالة جميع الأنسجة المحيطة بعناية من قطعة سنتيمتر مكعب واحد تقريبا من عينة الأنسجة ، ووضع أنسجة الأوتار النظيفة في 10 مل من PBS بمجرد قصها. ثم قم بإصلاح حوالي نصف الأنسجة المحصودة في 10٪ فورمالين محايد في غطاء دخان كيميائي لمدة 12 ساعة. لإنشاء مزرعة tenocyte ، قم بنقل النصف الآخر من عينات الأنسجة المحصودة والمتدهورة إلى أطباق زراعة الأنسجة الفردية التي تحتوي على PBS طازج وفرم الأنسجة إلى متر مكعب واحد أو قطع أصغر ، وهضم شظايا الأنسجة في 30 مل من DMEM مكملة ب 30 ملليغرام لكل مليلتر من الكولاجيناز اثنين لكل مجموعة أنسجة عند 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة.

في نهاية عملية الهضم ، قم بتصفية المحاليل الخلوية من خلال مصافي خلايا فردية 100 ميكرون وقم بإلغاء تنشيط الكولاجيناز باستخدام مليلتر واحد من FBS لكل أنبوب. اجمع الخلايا الوترية عن طريق الطرد المركزي وأعد تعليق الكريات بثلاثة أضعاف 10 إلى الخلايا الخامسة لكل 10 ملليلتر من DMEM مكملا بتركيز محلول مضاد للفطريات بنسبة 10٪ FBS و 1٪ مضاد حيوي ومضاد للفطريات. بعد ذلك ، قم بزرع الخلايا في طبق استزراع واحد بطول 100 سم لكل حالة ، وقم بزراعة الخلايا في حاضنة 37 درجة مئوية و 5٪ من ثاني أكسيد الكربون لمدة أسبوع واحد ، مع تغيير وسط الاستزراع كل ثلاثة أيام حتى يتم الوصول إلى التقاء 80٪.

للتحليل الكيميائي المناعي ، انقل مرتين في 10 إلى الخلايا الخامسة في 200 ميكرولتر من الوسط الطازج إلى كل بئر من شريحة غرفة واحدة مكونة من ثمانية آبار لكل مجموعة تجريبية وقم بزراعة الخلايا إلى التقاء لمدة 24 ساعة. في اليوم التالي ، اغسل الخلايا باستخدام PBS ، متبوعا بالتثبيت ب 500 ميكرولتر من 4٪ فورمالديهايد لكل بئر ، والنفاذية بنسبة 0.5٪ تريتون × 100 في PBS لمدة 10 دقائق. لمنع أي ارتباط غير محدد ، احتضان الخلايا بألبومين مصل البقر بنسبة 1٪ ، و 0.05٪ توين 20 في PBS ، حسب الاقتضاء تجريبيا ، متبوعا بالحضانة مع الأجسام المضادة الأولية ذات العلامات الفلوريسنتية ذات الأهمية عند أربع درجات مئوية بين عشية وضحاها محمية من الضوء.

في صباح اليوم التالي ، قم بتسمية الخلايا بالأجسام المضادة الثانوية المناسبة لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة المحمية من الضوء ، وقم بتركيب العينات ب 0.5 ميكرولتر من وسط تركيب مضان مناسب لكل حجرة. ثم قم بتصوير العينات على مجهر مضان تحت هدف 400 مرة. للتحليل المرضي للأنسجة ، قم بتضمين عينات الأنسجة الوترية الرسمية والثابتة في أربعة إلى خمسة ملليلتر من البارافين واحصل على أربعة إلى خمسة أقسام ميكرون من كل كتلة بارافين.

بالنسبة للهيماتوكسيلين في اليوزين ، أو تلطيخ H & E ، قم بإزالة العينات بثلاث غمرات لمدة خمس دقائق في الزيلين متبوعة بالترطيب مع غمر الإيثانول المتدرج وغسل ماء الصنبور لمدة دقيقتين. بعد ذلك ، قم بتسمية العينات بالهيماتوكسيلين لمدة خمس دقائق ، متبوعة بغسل الماء لمدة دقيقتين. اغمس العينات المغسولة في 1٪ حمض الهيدروكلوريك و 70٪ الإيثانول لمدة ثلاث ثوان ، متبوعا بغسل الماء لمدة ثلاث دقائق.

قم بتحييد الحمض بغمس 10 ثوان في 0.5٪ أمونيا ، متبوعا بغسل الماء لمدة ثلاث دقائق. قم بتسمية العينات المعادلة باليوزين لمدة خمس دقائق ، وقم بتجفيف العينات الملطخة ب H & E بغمر الإيثانول المتدرج. بعد ثلاث مرات غمر الزيلين ، قم بتركيب العينات بوسيط تركيب مناسب وشريحة غطاء.

لإجراء التحليل الكيميائي المناعي لعينات الأنسجة ، استخدم مجموعة الكشف عن بوليمر السندات المكرر وفقا لتعليمات الشركة المصنعة مع التعديلات الطفيفة التالية. بعد إزالة البارافينات بالزيلين كما هو موضح ، اغمر العينات في محلول استرجاع حاتمة السندات لمدة 30 دقيقة عند 100 درجة مئوية لاسترجاع المستضد ، متبوعا بحضانة لمدة خمس دقائق في بيروكسيد الهيدروجين لإخماد أي بيروكسيداز داخلي. بعد ذلك ، قم بتسمية الأقسام لمدة خمس عشرة دقيقة في درجة حرارة الغرفة بالأجسام المضادة الأولية ذات الأهمية.

في نهاية الحضانة ، قم بتسمية العينات بنظام الأجسام المضادة الثانوية المناسب لرابط الفجل البوليمري الخالي من البيوتين لمدة 50 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. ثم قم بتركيب الأقسام بزلة غطاء في وسط التثبيت المناسب وقم بتصوير العينات على مجهر ضوئي بتكبير 400 مرة. تكشف تحليلات H & E أن الأنسجة التي يتم حصادها من التهاب اللقيمة الجانبي المتدهور تظهر حزم الكولاجين غير المنظمة مع فقدان القطبية وهياكل الألياف المتوازية الدقيقة والمستقيمة والمعبأة بقوة.

في الواقع ، تعتبر حزم الكولاجين إيجابية لتلوين Alcian Blue في أقسام الأنسجة المتدهورة مما يشير إلى زيادة وجود البروتيوغليكان والجليكوزامينوجليكان داخل الأنسجة التالفة. يشير التحليل الكيميائي المناعي للأوتار المتدهورة أيضا إلى رد فعل إيجابي حبيبي سيتوبلازمي لعامل نمو بطانة الأوعية الدموية الذي لم يتم ملاحظته في عينات أنسجة الأوتار السليمة للتحكم يمكن تأكيد كلا النوعين من خلايا عينة الأنسجة المستنبتة على أنها خلايا موترة عن طريق الكيمياء المناعية فلورية حيث تعبر معظم الخلايا المستنبتة عن علامات موترات تمثيلية مثل بروتينات الموهوك والتينومودولين وتظهر مظهرا ممدودا.

وتجدر الإشارة إلى أن الخلايا التونكسية تظهر أيضا معدل انتشار أعلى في الثقافة مقارنة بالخلايا الودية التي يتم حصادها من الضوابط الصحية بالإضافة إلى تعبير أعلى عن جينات متعددة معروفة بأنها مرتبطة بتطور اعتلال الأوتار. في الختام ، يمهد هذا البروتوكول الذي تم التحقق من صحته باستخدام الخلايا التنكسية الطريق للتحقيقات المستقبلية في بيولوجيا الأوتار واختبار التدخلات الجديدة.