أسلوب الرواية بلازميد الحمض النووي إيصالها إلى الماوس المثانة أوروثيليوم انهانسر

الهدف العام من هذه الطريقة هو توصيل بلازميدات الحمض النووي إلى بوليثيل المثانة للفئران الحية في الجسم الحي من أجل الإفراط في التعبير الجيني أو تحرير الجينوم. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة عن الأسئلة الرئيسية في مجال سرطان المثانة ، مثل كيف تعزز الطفرات الجينية المختلفة تطور سرطان المثانة؟ الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها توفر طريقة سريعة ومريحة لتوصيل الجينات إلى المثانة دون مخاوف تتعلق بالسلامة والحواجز التقنية المرتبطة بالنواقل الفيروسية.

خطرت لي لأول مرة فكرة هذه الطريقة المتمثلة في محاولة استخدام أي فيروسات مرتبطة هندسيا لتوصيل الحمض النووي ، والتي لم تعمل بشكل جيد في المثانة. يمكن أن يمتد تأثير هذه التقنية أيضا إلى العلاج الجيني لأن التثقيب الكهربائي يمكن أن يحقق توصيلا فعالا لبلازميدات الحمض النووي إلى خلايا الظهارة البولية. سيظهر الإجراء أوفير ستيفانسون ويولي ليو من مختبري.

لبدء هذا الإجراء ، قم بتعقيم جميع الأدوات الجراحية وتعقيم مساحة العمل بنسبة 70٪ من الإيثانول. رش الأدوات الجراحية والقفازات بنسبة 70٪ من الإيثانول بشكل متكرر عند إجراء الإجراءات اللاحقة للحفاظ على ظروف معقمة. للبدء ، قم بتخدير الفأر وحلق منطقة الجراحة.

لاستنفاد البول ، ضع مادة التشحيم على القسطرة وتأكد من تغطية سطحها الخارجي بالكامل. بعد ذلك ، أدخل القسطرة في فتحة مجرى البول بالفأر وادفعها ببطء حتى تصل إلى المثانة. اضغط برفق على البطن للمساعدة في استنفاد البول.

بعد ذلك ، تخلص من البول بماصة في دورق نفايات ، ثم قم بإخراج 80 ميكرولترا من PBS في الطرف الخارجي للقسطرة مع بقاء الطرف الآخر في المثانة. بعد ذلك ، قم بتوصيل حقنة ملليمتر واحد بعناية بالقسطرة. ادفع المحقنة برفق لحقن PBS في المثانة.

اترك بعض PBS في القسطرة لتجنب تكوين فقاعات هواء في المثانة. بعد ذلك ، قم بإزالة المحقنة وانتظر حتى يتم تصريف PBS من المثانة. اضغط برفق على البطن لإخلاء PBS ، ثم تخلص من PBS في القسطرة باستخدام ماصة في دورق النفايات.

كرر غسل PBS مرتين أخريين. لكل مثانة تقوم بتعدادها ، قم بإعداد ما لا يقل عن 20 ميكرولترا من بلازميد الحمض النووي بمعدل ميكروغرام واحد لكل ميكرولتر. بعد ذلك ، أضف ميكرولتر واحد من التريبان الأزرق إلى 20 ميكرولترا من محلول البلازميد وأنبوب طرد مركزي دقيق 1.5 مليلتر وماصة لخلطهم جيدا.

لتوصيل البلازميد ، ضع 70٪ من الإيثانول على البطن. قم بعمل شق عمودي بطول سنتيمتر واحد لفتح جلد البطن فوق المثانة. بعد ذلك ، قم بقطع طبقة العضلات لفضح المثانة.

ضع الماصة ما لا يقل عن 20 ميكرولترا من البلازميد بالإضافة إلى محلول التريبان الأزرق في الطرف الخارجي للقسطرة وافصلها عن المحقنة. ثم حقن محلول البلازميد في المثانة. إذا تحولت المثانة إلى اللون الأزرق ، يكون الحقن ناجحا.

اترك بعض السوائل في القسطرة لتجنب تكوين فقاعات هواء في المثانة. بعد ذلك ، أمسك مجرى البول الخارجي وقم بإزالة القسطرة والحقنة. استخدم خيطا لشد فتحة مجرى البول الخارجية.

اصنع حلقتين بالخيط ، ثم اربطه بعقدتين. هذه خطوة حاسمة تتطلب من شخصين التعاون. تأكد من إحكام العقد حتى لا تتسرب البلازميدات.

الآن ، قم بتشغيل مولد التثقيب الكهربائي. اضغط على المثانة بقطبين كهربائيين وادفع دواسة القدم لإجراء التثقيب الكهربائي. للحفاظ على المثانة مدعومة ، يمكن للمرء أن يضغط على الجزء الخلفي من شق البطن بالملاقط.

تجنب أي اتصال بين الملقط والأقطاب الكهربائية لأن ذلك قد يولد شرارة. عند الانتهاء ، قم بخياطة فتحة البطن والجلد بخياطة جراحية معقمة. قم بإزالة السلسلة وتطبيق المقاطع.

ضع اليود على الجرح ، ثم قم بإزالة من نظام الأيزوفلوران. تطبيق مسكن البوبرينورفين تحت الجلد لتخفيف الألم بعد الجراحة. احتفظ بالحيوان على وسادة التدفئة وأعده إلى قفص المنزل بعد الشفاء التام.

افحص مرة واحدة على الأقل يوميا بحثا عن سلوكيات الحركة الطبيعية والشرب والتغذية ، ولا توجد علامات للعدوى حتى يلتئم الشق. ثم ، بعد أسبوع ، قم بإزالة المقاطع. قم بإعطاء الحقن اللاحقة من مسكن البوبرينورفين إذا ظهرت على أعراض الألم مثل انخفاض الاستمالة وزيادة العدوانية والنطق.

لإثبات التوصيل الجيني الناجح إلى ظهارة البولي في المثانة ، تم حقن 20 ميكرولترا من بلازميد pCAG-GFP ومحلول التريبان الأزرق من خلال مجرى البول وتم إعطاء خمس نبضات كهربائية. يظهر هنا التثقيب الكهربائي الناجح الذي حول المثانة إلى اللون الأخضر بعد 48 ساعة ، في حين أن المثانة ذات التحكم السلبي التي لم تخضع للتثقيب الكهربائي لم تظهر أي إشارة GFP. تم إجراء تلطيخ الفلورسنت المناعي لأنسجة المثانة المقطعة باستخدام الأجسام المضادة CK5 و CK18 و GFP.

لوحظ أن إشارة GFP موجودة في الخلايا المظلة والمتوسطة والقاعدية ، ولكن ليس في الطبقة العضلية مما يشير إلى خصوصية جيدة لتوصيل البلازميد إلى الظهارة البولية. بمجرد إتقانها ، يمكن تنفيذ هذه التقنية في 15 دقيقة إذا تم إجراؤها بشكل صحيح. بعد تطويرها ، تمهد هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال سرطان المثانة لبناء نماذج جديدة من الفئران الأصلية لدراسة آليات تطور المرض.