عزل محتويات الخزان الغدة الفك السفلي من Bornean ' تنفجر النمل (Formicidae) لتحليل فولاتيلومي GC-MS وميتابوليتيديتيكتور

يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في استقلاب الحشرات. يمكن استخدام نهج توصيف المستقلب لدراسة البيئة الكيميائية للنمل من خلال توضيح دور المواد المتطايرة في التفاعل مع الكائنات الحية الأخرى. الميزة الرئيسية لسير العمل المقدم هي: أنه يتكون من جزأين متميزين يمكن تطبيقهما بشكل مستقل.

أولا ، العزل المادي لخزان الغدة السفلية ومحتواه ، وثانيا ، التنميط غير المستهدف وتحديد المكون العضوي المتطاير ، في العينة البيولوجية ذات الأهمية. ستظهر الإجراء ميكايلا هونيجسبيرغر ، طالبة دكتوراه موهوبة من مختبري. قبل تشريح النمل ، في غطاء الدخان ، قم بتنظيف طبق بتري زجاجي وأدوات التشريح باستخدام المناديل الورقية ومزيج واحد زائد واحد بالحجم من الميثانول والماء.

قم بتخزين الطبق على حرارة 20 درجة مئوية تحت الصفر. بعد ذلك ، خذ كتلة قوارير الخيط القصير سعة 1.5 مليلتر بما في ذلك أغطية المسمار التي تحتوي على السيليكون PTFE Septa. قم بتخزين القوارير على الثلج.

بعد ذلك ، ضع كمادة باردة مجمدة قابلة للطرق في صندوق رغوة البوليسترين. ثم قم بتحميل طبق بتري فوق العبوة الباردة وضع نملة مجمدة في الطبق. الآن ، افحص النملة بمجهر ستيريو.

تحقق من سلامة مقصورات المعدة. يجب أن يكون للنملة منطقة معدة سليمة. لا تستخدم النمل ذو الفراغات المسطحة أو آثار محتوى خزان الغدة السفلية المتصلبة على أسطح الجسم.

الآن ، اعزل محتويات خزان الفك السفلي عن النملة. استخدم الملقط للإمساك بالبروبوديوم والسويقات ، ثم اسحب أجزاء الجسم هذه برفق. بعد ذلك ، أمسك المعدة عند الترجيت الرابع باستخدام ملقط دقيق.

باستخدام زوج آخر من الملقط ، أمسك الترجيت واحد وقم بإزالة الترجيت برفق عن طريق تقشيره. كرر هذه العملية لتمزيق الترجيت الثاني والثالث ، بحيث يكون جزء الكاسترول من خزانات الغدة السفلية مرئيا في الغالب. خزانات الغدة السفلية صفراء اللون في النمل العامل C.Explodens ، ولكن يمكن أن يتراوح اللون من الأبيض إلى الأصفر ، إلى الأحمر في الأنواع الأخرى.

بعد ذلك ، باستخدام إبرة تشريح ، قم بإزالة المحتويات الشبيهة بالشمع برفق من خزانات الغدة السفلية المقترنة عن طريق خدشها من حجرة المعدة. قم فقط بإزالة تلك الأجزاء من محتويات خزان الغدة السفلية التي يمكن عزلها دون الضغط على الغدد الأخرى وهياكل الجسم الموجودة في معدة النمل. ليس من الضروري جمع كل محتويات خزان الغدة السفلية.

الآن ، التقط محتويات خزان الغدة الفكية السفلية عن طريق لمسها برفق بطرف إبرة التشريح حتى تلتصق بها. ثم نقل محتويات الغدة إلى قارورة الخيط القصير الباردة 1.5 ملليلتر. قد يكون من الضروري تحريك طرف الإبرة على طول جدار القارورة وتشويه محتوى الغدة على جدار القارورة.

احتفظ بالمجموعة مغطاة وعلى الجليد حتى يمكن تحليلها. بين التشريح ، أعد تنظيف الأدوات والطبق بخليط الميثانول والماء. لعمل عينة تحليلية واحدة ، اجمع بين محتويات خزان الغدة لعدة نمل.

في هذه الحالة ، يتم تجميع محتويات الغدة من خمسة نمل عامل C.explodens. للتحكم ، اجمع العينات المكونة من غدة دوفور المجاورة لخزانات الغدة السفلية. قبل استخراج المحتويات الغدية ، حدد كتل العينات التحليلية.

ثم أضف 14 جزءا من أسيتات الإيثيل عالية النقاء المثلجة من حيث الحجم ، إلى جزء واحد من الأنسجة بالكتلة. دوامة التحضير لمدة خمس دقائق في ظل ظروف باردة. بعد ذلك ، قم بالطرد المركزي للعينات لمدة 10 دقائق وجمع المواد الطافية.

من المتوقع أن يكون حوالي 55 إلى 75 ميكرولترا من المادة الطافية من عينة من خمسة نمل. انقل كل مادة طافية إلى قارورة خيط قصيرة مسبقة التبريد سعة 1.5 ملليلتر مع إدراج دقيق سعة 0.1 مليلتر ، وأغلق القوارير بإحكام باستخدام أغطية لولبية تحتوي على ثقوب ومطاط أحمر PTFE Septa. للحصول على تسلسل قياس GCMS كامل ، قم بإعداد قارورة 1.5 ملليلتر قصيرة الخيط مع خليط معايرة مؤشر الاحتفاظ ، مصنوع عن طريق تخفيف محاليل الألكان القياسية المتاحة تجاريا في الهكسان ، إلى ثمانية ملليغرام لكل مليلتر لكل مركب.

ثم قم بإعداد قارورة أخرى من أسيتات الإيثيل النقي لتكون بمثابة مذيب فارغ. على صينية أخذ العينات الأوتوماتيكية المبردة لكروماتوجراف الغاز ، قم أولا بتحميل المذيب الفارغ ، وثانيا ، خليط العيار لمؤشر الاحتفاظ ، وثالثا ، مستخلص محتوى خزان الغدة الفك السفلي ، ورابعا ، مستخلص محتوى غدة دوفور. ضع العينات مع الدرج على الثلج لنقلها إلى كروماتوجراف الغاز.

أدخل الدرج في جهاز أخذ العينات التلقائي المبرد. لكل عينة ، قم بحقن ميكرولتر واحد أليكوات في مواصفات كتلة GC للفصل الكروماتوغرافي على عمود مناسب للمركبات المستهدفة. مثل عمود واجهة مستخدم HP-5MS.

بعد ذلك ، قم بتعيين معلمات GC المناسبة. على سبيل المثال ، استخدم الهيليوم في الغاز الناقل بتدفق عمودي ثابت يبلغ ملليلتر واحد في الدقيقة. استخدم منحدر درجة حرارة الفرن يبدأ من 40 درجة مئوية لمدة دقيقتين ، متبوعا بمنحدر 10 درجات مئوية في الدقيقة حتى 330 درجة مئوية.

تليها فترة سكانها لمدة سبع دقائق. باستخدام هذه المعلمات ، اضبط درجة حرارة المدخل على 270 درجة مئوية. الآن ، إذا لزم الأمر ، اضبط نسب الانقسام لمواصفات كتلة GC.

الحقن بحيث توفر أشكال الذروة الكافية والشدة للمركبات ذات الأهمية. اضبط درجة الحرارة الإضافية على 350 درجة مئوية. للمواصفات الشاملة.

استخدم المعلمات التالية. درجة حرارة مصدر التصلب العصبي المتعدد 230 درجة مئوية ، ودرجة حرارة رباعية للتصلب العصبي المتعدد تبلغ 150 درجة مئوية ، وتتراوح الفحص من الكتلة المنخفضة 30 إلى الكتلة العالية 500 ، مما يؤدي إلى معدل مسح يبلغ حوالي ثلاث عمليات مسح في الثانية. وتأخير المذيب لمدة 4.1 دقيقة للمذيب الفارغ والعينات التجريبية ، أو تأخير المذيب لمدة 6.1 دقيقة لخليط العيار لمؤشر الاحتفاظ.

عند اكتمال القياسات ، افتح برنامج تحليل بيانات GCMS ، وقم بتصدير البيانات كملف مشروع AIA ، إلى جهاز تخزين محمول لتسهيل نقل البيانات إلى جهاز كمبيوتر مزود بنظام تشغيل 64 بت يستند إلى Linux. لتحليل البيانات ، اتبع وصف نص البروتوكول لاستخدام برنامج كاشف المستقلب. في الحقل ، تم جمع النمل وتجميده عند درجة حرارة 20 درجة مئوية تحت الصفر لمدة يومين ، ثم تخزينه عند 80 درجة مئوية تحت الصفر حتى يتم تحليله.

تم تجميع محتويات خزان الغدة السفلية من خمسة نمل عامل C. Explodens ، وقياسها بواسطة GCMS. كشف تحليل البيانات عن العشرات من مركبات محتوى الغدة المفترضة. تسبب المستقلبان السائدان في مستخلص محتوى خزان الغدة الفك السفلي في زيادة الحمل على العمود.

ولهذا السبب تم تحليل نفس العينة مرة أخرى بنسبة تقسيم أعلى تبلغ 50 إلى واحد. تم التحقيق في التلوث المتبادل لمحتوى خزان الغدة السفلية حسب تكوين غدة دوفور من خلال أخذ عينات من غدة دوفور لفحصها. أظهرت هذه الملوثات أوقات احتفاظ متأخرة ، بدءا من حوالي 29 دقيقة.

تم تحديد مستقلبات محتوى خزان الغدة السفلية المفترضة المكتشفة بناء على مزيج من تشابه الطيف ومؤشر الاحتفاظ مع مكتبة داخلية. بهذه الطريقة كان من الممكن تأكيد هوية حوالي 10٪ من المستقلبات المكتشفة ، وبعضها مدرج كمركبات من واحد إلى خمسة. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية عزل واستخلاص وتحديد مستقلبات واحدة لمرة واحدة عن طريق اختيار قياس مرض التصلب العصبي المتعدد.

بمجرد إتقانها ، يمكن إجراء العزل واستخراج المذيبات والحصول على البيانات لنفس العينة في غضون ساعتين تقريبا إذا تم إجراؤها بشكل صحيح. اعتمادا على مدى تعقيد ملف تعريف المركب العضوي المتطاير ، سيختلف الوقت اللازم لتقييم البيانات. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر الحفاظ على تبريد العينة بشكل دائم ، من التجميع حتى التحليل.

علاوة على ذلك ، قبل القسم ، يجب التحقق من أن معدة النملة سليمة جسديا. يمكن أيضا دمج هذا الإجراء مع القياس الكمي المقارن أو المطلق للمستقلبات ، من أجل الإجابة على أسئلة إضافية ، مثل التركيب الأيضي ، والظروف البيئية المختلفة ، أو الكميات المطلقة من التكوين المعلب. بشكل ملائم ، يمكن أيضا تطبيق خطوات الاستخراج والقياس وتقييم البيانات الخاصة بهذا البروتوكول على أنظمة بيولوجية متعددة ، مثل الحشرات الأخرى أو الكائنات الحية الدقيقة أو النباتات.