وصف جليكوبروتينس مع حظيرة الغلوبولين المناعي علم البلورات بالأشعة السينية والتقنيات الفيزيائية الحيوية

يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال البروتين السكري. توفير نظرة ثاقبة لوظيفة البروتين ، ودور الجليكان المرتبط ب N ، وآلية وعمل المضادات الحيوية التي تستهدف البروتين السكري. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنه يمكن تطبيقها على أي بروتين سكري ذي أهمية.

تسهيل التوصيف الهيكلي والفيزيائي الحيوي لمجموعة واسعة من أهداف البروتين السكري. سيوضح هذا الإجراء هونغ تسوي ، منسق مشروع بحثي في مختبرنا. للبدء ، قم بإعداد الخلايا ونقلها كما هو موضح في بروتوكول النص.

حصاد الخلايا عن طريق الطرد المركزي عند 6 ، 371 مرة جم وأربع درجات مئوية لمدة 20 دقيقة. احتفظ بالمادة الطافية ثم استخدم مرشحا 0.22 ميكرون لتصفيته. قم بتحميل المادة الطافية المفلترة بمعدل أربعة ملليلتر في الدقيقة على عمود Ni-NTA في نظام كروماتوغرافيا علوي.

بعد ذلك ، اغسل العمود بثلاثة إلى أربعة أحجام من مخزن الغسيل المؤقت. قم بتخفيف البروتين السكري المنقى من العمود باستخدام تدرج عازلة للشطف ، أثناء جمع الكسور. اسحب الكسور التي تحتوي على الذروة المراوغة في جهاز ترشيح الطرد المركزي بحد وزن جزيئي اسمي يبلغ 10 كيلودالتون.

ثم ركز عن طريق الطرد المركزي عند 4،000 مرة جم وأربع درجات مئوية لمدة 15 دقيقة أو حتى تصل العينة إلى حجم 500 ميكرولتر. حقن البروتين السكري المركز في حلقة عينة سعة 500 ميكرولتر. قم بتحميل البروتين السكري على عمود استبعاد حجم عالي الأداء متوازن مسبقا على نظام FPLC عند أربع درجات مئوية أثناء جمع الكسور.

بعد ذلك ، قم بتشغيل جل SDS-PAGE لتحديد الكسور المراوغة التي تحتوي على البروتين السكري وسحب تلك التي تحتوي على البروتين السكري. باستخدام جهاز ترشيح الطرد المركزي بحد وزن جزيئي اسمي يبلغ 10 كيلو دالتون ، قم بتركيز ECD النقي منزوع الجليكوزيل عند 4 ، 000 مرة جم وأربع درجات مئوية حتى يتم الحصول على التركيز المطلوب. بعد تحديد تركيز البروتين ، قم بالطرد المركزي للعينة عند 12 ، 000 مرة جم وأربع درجات مئوية لمدة خمس دقائق ، لإزالة الغبار والملوثات الأخرى.

بعد ذلك ، أضف 80 ميكرولترا من محلول التبلور من شاشة التبلور التجارية إلى كل بئر خزان في لوحة بلورة قطرة 96 بئر. استخدم روبوت التبلور لتوزيع قطرات من البروتين في آبار لوحة التبلور. باستخدام حجم قطرة إجمالي يبلغ 200 نانولتر بنسبة واحد إلى واحد من البروتين المنقى إلى محلول التبلور.

بعد ذلك ، ختم اللوحة بشريط لاصق. انقل اللوحة المختومة إلى جهاز تصوير لوحة لفحصها بواسطة الضوء المرئي والأشعة فوق البنفسجية. حدد الظروف التي تعطي رؤوسا بلورية أولية للبروتين السكري وقم بتحسين هذه البلورات بشكل أكبر كما هو موضح في بروتوكول النص.

بحماية البلورات بالتبريد عن طريق نقعها في محلول من الخمور الأم مكمل بنسبة 20٪ من الجلسرين. ثم قم بتركيب البلورات في CryoLoops. باستخدام النيتروجين السائل ، قم بتجميد البلورات المركبة قبل جمع البيانات.

بعد إنتاج بلورات حيود جيد في صفيحة بلورة 24 بئرا ، قم بإعداد محلول مخزون من 50 ملليمولار ليجند و 20 ملليمولار تريس عند درجة الحموضة 9.0 مع 150 مللي مولر كلوريد الصوديوم. أضف تركيزات مختلفة من محلول الترابط هذا إلى القطرة المعدة مسبقا التي تحتوي على بلورات ECD. أغلق القطرة لأطوال فترة الحضانة التي تتراوح بين خمس دقائق وخمسة أيام.

باستخدام المجهر الضوئي ، تتبع البلورات بصريا لتحديد أي تغييرات محتملة في التشكل. بعد الحضانة ، قم بتركيب البلورات باستخدام CryoLoops وقم بحمايتها بالتبريد في محلول الخمور الأم المكمل بنسبة 20٪ من الجلسرين. لبدء قياس تداخل الطبقة الحيوية ، قم بإعداد 50 ملم من 1X Kinetics Buffer من 10X Kinetics Buffer كما هو موضح في بروتوكول النص.

أضف 200 ميكرولتر من هذا المخزن المؤقت إلى لوحة ما قبل الترطيب. انقل ستة مستشعرات حيوية Ni-NTA إلى اللوحة واتركها ترطب في المخزن المؤقت لمدة 10 دقائق. بعد ذلك ، قم بتخفيف ECD الموسومة به في مليلتر واحد من 1X Kinetics Buffer بتركيز نهائي قدره 25 نانوجرام لكل ميكرولتر.

وإعداد التخفيفات التسلسلية لبنك أبوظبي الأول المنقى. الآن قم بتسخين الكواشف في صفيحة صغيرة سعة 96 بئر ، كما هو موضح هنا. حيث يمثل B 1X Kinetics Buffer ، يمثل L تحميل البروتين السكري الموسوم به ، وتمثل الإدخالات العددية تركيزات FAB المخففة ، ويمثل R المخزن المؤقت للتجديد.

انقل المستشعرات الحيوية المائية إلى آبار تحتوي على 1X Kinetics Buffer لمدة 60 ثانية لتأسيسها. بعد ذلك ، قم بتحميل البروتين السكري بتركيز 25 نانوجرام لكل ميكرولتر لمدة 240 ثانية عند 1,000 دورة في الدقيقة. ضع المستشعرات الحيوية مرة أخرى في الآبار التي تحتوي على 1X Kinetics Buffer لمدة 60 ثانية لخط الأساس الثاني.

انقل المستشعرات إلى الآبار التي تحتوي على التخفيفات التسلسلية ل FAB لمدة 180 ثانية. بعد مرحلة الارتباط هذه ، انقل المستشعرات الحيوية مرة أخرى إلى 1X Kinetics Buffer لخطوة تفكك مدتها 180 ثانية. بعد ذلك ، افتح برنامج التحليل.

ضمن علامة التبويب الأولى، قم باستيراد البيانات ثم حددها. ضمن علامة التبويب الثانية ، الخطوة الأولى لتحديد البيانات ، اختر اختيار المستشعر. قم بتمييز الآبار المرجعية ، ثم انقر بزر الماوس الأيمن لتعيين البئر المرجعي.

في الخطوة الثانية ، الطرح ، حدد الآبار المرجعية. بعد ذلك ، ضمن الخطوة الثالثة محاذاة المحور Y ، حدد خط الأساس وقم بتعيين نطاق زمني من 0.1 ثانية إلى 59.8 ثانية. في الخطوة الرابعة، حدد التصحيح بين الخطوات والمحاذاة مع التفكك.

ثم في الخطوة الخامسة ، قم بمعالجة تصفية Savitzky-Golay وانقر فوق بيانات المعالجة. بوابة علامة التبويب الثالثة. ضمن الخطوة الثانية ، قم بالتحليل باستخدام نموذج واحد إلى واحد ، وحدد الاقتران والتفكك ، وحدد التركيب العام والتجميع حسب اللون.

انقر بزر الماوس الأيمن فوق المنحنيات ، وانقر فوق تعيين اللون وتعيين جميع المنحنيات على الألوان المطلوبة. بعد ذلك ، حدد منحنيات مناسبة. إذا كانت البيانات ملائمة بشكل جيد، فقم بتصدير النتيجة بالنقر فوق حفظ التقرير.

كرر التجربة لجميع الظروف المرغوبة. في هذه الدراسة ، تم استنساخ العديد من تركيبات المجال خارج الخلية CD22 بنجاح في متجه تعبير pHL-sec. ثم يتم التعبير عن هذه التركيبات في خطوط خلايا الثدييات HEK293-F و HEK293-S.

في حين أن الثقافات التي تحتوي على ما يقرب من مليون ومليون ونصف خلية لكل مليلتر ، عبرت عن مستويات متشابهة جدا من البروتينات السكرية. عبرت ثقافات نصف مليون خلية فقط لكل مليلتر عن أقل بشكل ملحوظ. بعد ذلك ، يتم حصاد الثقافات وعزل البروتين السكري في مرحلة الطفولة المبكرة عن طريق كروماتوغرافيا استبعاد التقارب والحجم لتنقية جميع التركيبات إلى تجانس الحجم.

إنتاج عينة عالية النقاء للبلورة والدراسات الفيزيائية الحيوية. باتباع هذه الإجراءات ، يمكن إجراء طرق أخرى مثل المجهر الإلكتروني للجسيمات المفردة من أجل الإجابة على أسئلة إضافية حول البنية ثلاثية الأبعاد للمجال خارج الخلية كامل الطول أو مجمعات البروتين. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية التعبير عن البروتينات السكرية وتنقيتها وتوصيفها هيكليا وفيزيائيا حيويا وروابط الأجسام المضادة المستهدفة.