الكشف عن هيتيروديميريزيشن Isoforms البروتين باستخدام في الموقع قرب ربط التحليل

في الموقع القرب مقارنة Assay أو جيش التحرير الشعبى الصينى، هي تقنية قادرة على الكشف عن التفاعلات بين البروتينات والأنسجة الملصقة والخلايا. يمكن تحديد الروابط بين البروتينات وتحديدها كمياً دون الحاجة إلى التعبير المعدل وراثياً أو التكنولوجيا الإضافية. والشرط الوحيد هو توافر أجسام مضادة محددة عالية الكفاءة يمكن تعديلها باستخدام أليوغنوكليوتيدات الحمض النووي.

في الأنسجة MST1 و MST2 موجودة أساسا كما هموديمير نشطة، ولكن المحفزات على الحساسية يمكن أن تزيد من مستوى MST1 MST2 heterodimers ومثل هذه هيتيروديمرات غير نشطة. بعد الحضانة مع أجسام مضادة التمهيدي محددة ضد البروتينات من الفائدة، يتم إضافة أجسام مضادة ثانوية محددة خاصة، كل إلى فريدة من نوعها، قصيرة، حبلا الحمض النووي مجانية تعلق عليه، إلى فتحة لربط الأجسام المضادة الأولية. إذا كانت البروتينات في الأسئلة هيترموديرized، كل من الأجسام المضادة الأولية والأجسام المضادة الثانوية ملزمة لهم سيكون على مقربة.

في هذه الحالة، يمكن أن تتفاعل خيوط الحمض النووي المرفقة على الأجسام المضادة الثانية من خلال إضافة لاحقة من اثنين من أوليغونوكليوتيدات الحمض النووي الأخرى تشكيل دائرة. يمكن أن يحدث تكرار عدة مئات من دائرة الحمض النووي بعد تفاعل التضخيم ويتم إنشاء إشارة الفلوريسنس عن طريق مسابير أوليغونوكليوتيدات مجانية. لذلك، يتم تصور كل إشارة تم الكشف عنها كنقطة فلورية فردية يمكن تعيينها إلى موقع فرعي محدد استنادًا إلى صور المجهر.

في اليوم السابق للتجربة، معطف 16 الشرائح جيدا الغرف بإضافة 50 إلى 100 ميكرولترات من الفأر أو بولي-L-ليسين واحتضان في 37 درجة مئوية. بعد 30 دقيقة إزالة حل الباردة، وتقسيم الخلايا باستخدام تريبسين ولوحة 15، 000 إلى 25، 000 الخلايا في بئر إلى 16 الشريحة جيدا الغرف. احتضان الخلايا في 37 درجة مئوية في حاضنة ثاني أكسيد الكربون المرطبة 5٪ لمدة 24 ساعة.

بعد 24 ساعة، قم بإزالة الوسط من الآبار وغسل الخلايا بلطف باستخدام PBS. استخدام micropipette لتقليل المخاطرة من العينة ثم التعرق في برنامج تلفزيوني وإصلاح الخلايا عن طريق إضافة 50 ميكرولترات من 4٪ PFA في البئر واحتضان لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة دون تحريض. لا pipette الحل مباشرة على الخلايا، كما أن ذلك قد يؤدي إلى مفرزة من الخلايا.

بعد التثبيت، وغسل الخلايا مع TBST ثلاث مرات لمدة خمس دقائق كل مع الانفعالات خفيفة. المقبل permeabilize الخلية واحتضان لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة دون تحريض. بعد اكتمال permeabilization، وغسل الخلايا مع TBST ثلاث مرات لمدة خمس دقائق لكل غسل مع الانفعالات.

بعد إزالة TBST إضافة قطرة واحدة من حل حجب في كل بئر واحتضان الشرائح في غرفة الرطوبة مسخن مسبقا لمدة ساعة واحدة في 37 درجة مئوية. تمييع الأجسام المضادة الأولية. قم بإزالة حل الحجب باستخدام ميكروسيبيت ولكن لا تسمح بالجفاف.

دوامة وإضافة 40 ميكرولترات من محلول الأجسام المضادة المخففة إلى الآبار المناسبة واحتضان العينات في 37 درجة مئوية في غرفة الرطوبة محمّاة مسبقا لمدة ساعة واحدة. أثناء الحضانة، تمييع اثنين من تحقيقات جيش التحرير الشعبى الصينى في تخفيف الأجسام المضادة. لكل عينة إعداد 40 ميكرولترات من تحقيق جيش التحرير الشعبي.

بعد ساعة واحدة من الحضانة، التعرق حل الأجسام المضادة وغسل الشرائح مرتين لمدة خمس دقائق مع TBST في درجة حرارة الغرفة. إزالة بلطف TBST من الشرائح وإضافة 40 ميكرولترات من حل التحقيق جيش التحرير الشعبى الصينى إلى كل بئر. احتضان الشرائح في غرفة الرطوبة محمّاة مسبقا لمدة ساعة واحدة في 37 درجة مئوية.

دوامة وتمييع الكميات المطلوبة من المخزون الربط 1 إلى 5 في المياه عالية النقاء مباشرة قبل الاستخدام. مطلوب 40 ميكروليتر من حل الربط لكل بئر. بعد الحضانة، إزالة حل جيش التحرير الشعبى الصينى من الشرائح وغسلها مرتين في TBST لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة مع الانفعالات.

استخدام كتلة تجميد عند إزالة ligase من الفريزر وقبل إضافته إلى الخلايا، دوامة وتمييع مع حل الربط. إزالة TBST من الشرائح وإضافة 40 ميكروليترات من الحل ربط ربط لكل بئر. يحتضن الشرائح في غرفة الرطوبة محمّاة مسبقا لمدة 30 دقيقة في 37 درجة مئوية.

بعد الاحتضان الحل وغسل مرتين مع TBST لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة مع الانفعالات. تجنب تعريض البئر للضوء الساطع حيث أن الكواشف حساسة للضوء. خلال الغسيل الأخير، دوامة وتمييع حجم متطلبات محلول التضخيم في المياه عالية النقاء مباشرة قبل الاستخدام.

الحفاظ على البوليميراز على الجليد أو في كتلة التبريد وقبل إضافته إلى دوامة الخلايا وتمييع مع حل التضخيم. استلهمي تبت من الآبار وأضف 40 ميكرولترات من محلول التضخيم لكل بئر. يحتضن الشرائح في غرفة الرطوبة المحمّاة داكنة لمدة 100 دقيقة في 37 درجة مئوية.

بعد الحضانة، وpireate محلول البوليميراز تضخيم من الشرائح وغسل مرتين عشر دقائق كل في TBST في درجة حرارة الغرفة. إزالة الغرف والسيليكون حول الآبار من الشريحة تماما. كشط قبالة الخرز المتبقية من السيليكون مع شفرة حلاقة.

رسم شبكة على الشريحة التي تفصل كل بئر. إضافة ما يقرب من 40 ميكرولترات من المتوسطة المتصاعدة مع DAPI، وضمان أن لا فقاعات الهواء أن يتم القبض تحت زلة الغطاء. استخدام طلاء الأظافر لإصلاح غطاء الزجاج.

يمكن إجراء التحليل المجهري في 20 دقيقة بعد التثبيت ، ولكن في الممارسة العملية نجد أنه من الأكثر ملاءمة لإجراء تحليل الصور في اليوم التالي. لتحليل العينات، نستخدم لايكا SP8 تكوين مجهر المسح الضوئي بالليزر. تظهر هنا أمثلة على مقايسة الربط القربي في الموقع تصور القرب بين البروتينات MST 1 و MST2 في خلايا الكلى الجنينية البشرية في الألواح A through D، وخلايا Schwann الإنسان في الألواح E من خلال H.In جميع الألواح نواة الخلية ملطخة باللون الأزرق من قبل DAPI والنقاط الحمراء تشير إلى إشارات اختبار التقارب الإيجابي الناتجة عن القرب الوثيق بين البروتينات المشار إليها.

لوحة أ يظهر القرب من MST1 و MST2 وتظهر لوحة B القرب من ERK وphosphoERK كما هي هذه الظهارات على نفس البروتين. يمثل C لوحة التحكم السلبي مثل هذه الخلايا مثل MST1 و MST2 و D يمثل التحكم السلبي الثاني ملطخة الأجسام المضادة ل MST1 و ERK التي لا يتوقع أن تكون على مقربة من بعضها البعض. لوحات E وF إظهار القرب من MST1 مع MST2 وERK مع phosphoERK في خلايا Schwann.

اللوحة G و H هي الضوابط السلبية الملطخة فقط مع الأجسام المضادة MST1 أو مع الأجسام المضادة MST1 و ERK. ومن الضروري استخدام الأجسام المضادة الأولية غير التفاعلية التي ينبغي أن تعترف عضو واحد فقط من هيتيروديمر. كما أنه من المهم أن نتذكر لاستخدام نصائح مختلفة لتجنب التلوث عبر الأجسام المضادة الأولية والتحقيقات جيش التحرير الشعبي، لتجنب لمس الجزء السفلي من البئر، وتجنب الأنابيب مباشرة على العينات.

بعد مشاهدة هذا الفيديو يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية استخدام PLA في الموقع لدراسة تضاؤل البروتين في الخلايا الثابتة.