صبغ FM ركوب الدراجات في المشبك: مقارنة Depolarization البوتاسيوم عالية، الكهربائية وتحفيز تشانيلرهودوبسين

الهدف العام من هذه التجربة هو مراقبة دورة الداخل والخروج الخلوي للحويصلات المشبكية على التحضير الحي للوصلة العصبية العضلية ذبابة الفاكهة باستخدام أصباغ FM الفلورية. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال علم الأعصاب ، مثل الجينات الحاسمة لوظيفة دورة الحويصلة المتشابكة؟ الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنه يمكنك تتبع دورة الحويصلة بصريا في تحضير مباشر باستخدام ثلاثة أنواع مختلفة من المحفزات ، أو إزالة الاستقطاب العالي من البوتاسيوم ، أو التحفيز الكهربائي ، أو استخدام علم البصريات الوراثي.

ليكون هذا الإجراء ، أضف الجسم المضاد المضاد ل HRP ، المقترن ب lexoflor 647 إلى المحلول الملحي التشريح. بعد ذلك ، أضف زلة غطاء مطلية بالتلاطن الصناعي إلى غرفة التشريح ثم أضف محلول التشريح بجسم مضاد HRP لوضع العلامات على الطرف المشبكي NMJ أثناء التشريح. باستخدام فرشاة رسم دقيقة ، انقل الطور الثالث المتجول من قارورة الطعام إلى زجاج غطاء مطلي بالمطاط الصناعي.

ثم املأ طرف ماصة زجاجية صغيرة بحجم صغير من الغراء ، باستخدام ضغط الهواء السلبي الناتج عن الفم. بعد ذلك ، ضع اليرقات ، الجانب الظهري لأعلى ، باستخدام ملقط وقم بلصق الرأس على زلة الغطاء المطلي باللدائن بقطرة صغيرة من الغراء باستخدام ضغط هواء إيجابي عن طريق الفم. كرر هذا الإجراء مع الطرف الخلفي لليرقات ، مع التأكد من أن مشدود بين مرفقي الغراء.

باستخدام المقص ، قم بعمل قطع أفقي بطول ملليمتر واحد في الخلف والعمودي على طول خط الوسط الظهري. ثم قم بإزالة القصبة الهوائية الظهرية والأمعاء والجسم الدهني والأعضاء الداخلية الأخرى برفق ، وتغطي العضلات. كرر إجراء اللصق للوحات جدار الجسم الأربعة ، مع التأكد من تمديد الجسم برفق أفقيا ورأسيا.

بعد ذلك ، ارفع VNC وقم بقطع الأعصاب الحركية بعناية بالمقص وقم بإزالة VNC تماما. استبدل محلول ملحي للتشريح بمحلول ملحي خال من الكالسيوم لإيقاف دورة SV. للتحفيز الكهربائي، قم بإعداد ماصة شفط باستخدام مجتذب القطب الكهربائي الدقيق للحصول على حجم الاستدقاق والطرف المطلوبين.

بعد ذلك ، قم بتلميع طرف القطب الكهربائي الدقيق باستخدام تشكيل دقيق لإنشاء نوبة محكمة عند امتصاص عصب حركي واحد. حرك ماصة الشفط على حامل القطب الكهربائي الموجود على مناور دقيق، متصل بأنبوب بلاستيكي طويل ومرن وحقنة. بعد ذلك ، ضع المستحضر بصبغة FM على مرحلة المجهر وارفع المسرح حتى يتم التركيز على اليرقات وماصة الشفط.

ثم امتصاص حلقة من العصب الحركي المقطوع ، مما يؤدي إلى تعصيب الجزء الهيمي المحدد بضغط هواء سلبي ، ناتج عن المحقنة في قطب الشفط. بعد ذلك ، قم بتحفيز العصب الحركي باستخدام المعلمات المحددة لدفع الالتقام الخلوي SV وامتصاص صبغة FM 143. الخطوة الأكثر أهمية في هذه المرحلة من الإجراء هي امتصاص محور عصبي محرك واحد في قطب الشفط بمقاس محكم.

قد يستغرق هذا بعض التجربة والخطأ. بمجرد العثور على قطب شفط مناسب ، استخدم نفس القطب لجميع الحالات التي تتم مقارنتها لضمان إجهاد تحفيز ثابت. لتفريغ صبغة FM ، امتصاص نفس العصب الحركي في نفس القطب الكهربائي ثم حفز العصب الحركي لتنشيط إفراز الخلايا SV وإطلاق صبغة FM 143.

لتحفيز channelrhodopsin ، قم بتوصيل مؤشر LED أزرق بمحفز قابل للبرمجة باستخدام كابل متحد المحور وضع مؤشر LED في منفذ الكاميرا. ركز شعاع ضوء LED الأزرق على المستحضر باستخدام صبغة FM باستخدام وظيفة التكبير المجهري. تتمثل الخطوة الأكثر أهمية في النقطة في الإجراء في التأكد من الحفاظ على إعدادات LED ثابتة وأنك تضيء نفس الجزء من كل لجميع الظروف التي تتم مقارنتها لضمان إجهاد تحفيز ثابت.

ابدأ التحفيز الضوئي وتتبعه باستخدام المؤقت للمدة المحددة مسبقا لفترة التحفيز البصري الوراثي. عندما يتوقف المؤقت ، قم بإزالة محلول صبغة FM بسرعة واستبدله بمحلول ملحي خال من الكالسيوم لإيقاف دورة SV. من تفريغ صبغة FM ، ابدأ تحفيز الضوء وتتبعه بمؤقت للمدة المحددة مسبقا لفترة تحفيز البصريات الوراثية.

عندما تنتهي فترة المؤقت ، قم بإزالة محلول صبغة FM بسرعة وضعه بمحلول ملحي خال من الكالسيوم لإيقاف دورة SV. لتحديد صورة الفلورسنت كميا، قم بتحميلها في الصورة J وقم بإنشاء إسقاط أقصى كثافة بالنقر فوق Image، Stacks، Zproject، ثم باستخدام قناة مكافحة HRP 647، انتقل إلى Image، Just، Threshold، وحرك شريط الأدوات العلوي حتى يتم تمييز NMJ فقط. باستخدام أداة العصا ، انقر فوق NMJ.

إذا كان NMJ متقطعا ، فاضغط مع الاستمرار على زر shift وحدد جميع الأجزاء. ثم قم بتغيير الصورة إلى قناة الصبغة FM 143 وانتقل إلى تحليل ، قياس ، للحصول على قياس الفلورة. كرر هذه الخطوات للصورة التي تم تفريغها من نفس NMJ.

يمكن تحويل الفلورسنت FM 143 إلى راسب كثيف للإلكترون DAB المؤكسد للتصور عبر TEM. فيما يلي رسم تخطيطي لطريقة تحويل الصورة لتسمية ذبابة الفاكهة NMJ بعد تحميل صبغة FM 143 المعتمد على النشاط. هذه صورة TEM تمثيلية لعروة متشابكة من النوع البري في حالة الراحة ، والتي تظهر مجموعة كثيفة من SVs ذات الحجم الموحد.

تظهر هذه الصور العروات المشبكية التي تم تحفيزها بإزالة الاستقطاب العالي من محلول ملحي البوتاسيوم لمدة خمس دقائق دون تحويل ضوئي أو مع تحويل ضوئي FM 143. يمكن ملاحظة هياكل الإنسان ذات النهاية السائبة هنا. وتظهر هذه الصور العروات المشبكية التي تم تحفيزها كهربائيا باستخدام قطب شفط الأعصاب عند 20 هرتز لمدة خمس دقائق بدون تحويل ضوئي أو مع تحويل ضوئي FM 143.

لاحظ أن الحويصلات المحملة بالصبغة تبدو أغمق بكثير من الحويصلات المجاورة غير المحملة. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إجراء تشريح غراء اليرقات بالإضافة إلى تحميل وتفريغ صبغة FM باستخدام إزالة الاستقطاب العالي من البوتاسيوم والتحفيز الكهربائي والقناة البصرية الوراثيةتحفيز رودوبسين. منذ أن تم تصنيع أصباغ FM لأول مرة بواسطة Fei-Mao ، فقد تم استخدام هذه الأصباغ متعددة الاستخدامات لدراسة التعبئة المعتمدة على النشاط لمجموعات الحويصلات المميزة لدراسة الفرق بين الالتقام الخلوي بوساطة الكلاثرين ، بالإضافة إلى دراسة الأنشطة المشبكية المستحثة والعفوية والمصغرة.

هناك العديد من العوامل التي يجب مراعاتها خلال هذه التجربة. على سبيل المثال لا الحصر ، تركيز الكالسيوم الخارجي ، ونوع طريقة التحفيز التي تستخدمها ، بالإضافة إلى مدة تحميل وتفريغ صبغة FM أثناء خطوات الامتصاص والإفراج. يرجى أخذ هذه العوامل في الاعتبار بعناية عند التخطيط لتجربتك الخاصة.

حظ سعيد!