التهجين في الموقع Fluorescence جزيء واحد (سمفيش) التحليل في مهدها الخميرة النمو الخضري والانقسام الاختزالي

الهدف العام من هذا التهجين المحسن للجزيء الواحد من الحمض النووي الريبي في الموقع ، أو smFISH ، هو اكتشاف جزيئات الحمض النووي الريبي الفردية وتحديدها على أساس كل خلية أثناء النمو الخضري والانقسام الاختزالي للخميرة الناشئة. تكشف هذه الطريقة عن تباين خلية إلى أخرى في التعبير الجيني على توطين الحمض النووي الريبي تحت الخلوي ، وبالتالي فهي تقنية قوية لدراسة تنظيم الجينات. بصرف النظر عن المعلومات الفريدة التي يمكن الكشف عنها بواسطة smFISH ، فإن الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنه بمجرد تحسينها ، فهي قوية وقابلة للتكرار بدرجة كبيرة.

سيتم استخدام ثقافة الانتصاف لعرض هذا البروتوكول. لإصلاح الثقافة في 3٪ فورمالديهايد ، أضف 1840 ميكرولترا من الثقافة إلى 160 ميكرولتر من 37٪ فورمالديهايد في أنبوب طرد مركزي دقيق سعة ملليلترين. اقلب حوالي خمس مرات للخلط.

ضع الأنبوب على أسطوانة أسطوانية في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة. بعد 20 دقيقة ، استمر في التثبيت عند أربع درجات مئوية مع الدوران طوال الليل. في اليوم التالي ، استعد للهضم عن طريق إذابة 200 مللي مولار من مجمعات فاناديل ريبونوكليوزيد ، أو VRC ، عند 65 درجة مئوية لمدة 10 دقائق على الأقل.

لتحضير مزيج الهضم الرئيسي ، قم بإدخال الماصة الأولى 2125 ميكرولتر من المخزن المؤقت B في أنبوب سعة 15 مل. ثم قم بتدوير VRC الدافئ لمدة خمس ثوان لإعادة تعليقه بالكامل وإضافة 200 ميكرولتر من VRC إلى أنبوب 15 ملليلترا. يجب أن يظهر المزيج باللون الأخضر البني الفاتح.

الطرد المركزي للعينة الانتصافية عند 21 ، 000 × جم لمدة دقيقة ونصف في درجة حرارة الغرفة. قم بشفط المادة الطافية بعناية ، ووضع طرف الفراغ على الجانب الآخر من الحبيبات لتجنب إزعاج الحبيبات. أعد تعليق الخلايا في مل ونصف من المخزن المؤقت البارد B عن طريق سحب العينات لأعلى ولأسفل للخلط.

جهاز طرد مركزي عند 21 ، 000 × جم لمدة دقيقة ونصف. قم بإزالة الجزء الأكبر من السائل عن طريق الشفط بالتفريغ ، تاركا وراءه حوالي 100 ميكرولتر. أعد تعليق الخلايا في واحد ونصف مل من المخزن المؤقت البارد B.الطرد المركزي للعينات ، وإزالة السائل ، وإعادة تعليق الخلايا في واحد ونصف من المخزن المؤقت البارد B مرة أخرى.

جهاز طرد مركزي عند 21 ، 000 × جم لمدة دقيقة ونصف. شفط السائل تماما عن طريق سحب العينات. أعد تعليق الخلايا في 425 ميكرولتر من مزيج الهضم الرئيسي والدوامة لفترة وجيزة.

أضف خمسة ميكرولترات من الزيمولياز إلى الأنبوب والدوامة لمدة ثانيتين إلى ثلاث ثوان للخلط. ضع الأنبوب على أسطوانة أسطوانية وهضمه على حرارة 30 درجة مئوية لمدة 15 إلى 30 دقيقة. بعد 15 دقيقة ، افحص الخلايا بالفحص المجهري كل خمس دقائق وأوقف عملية الهضم عندما تظهر حوالي 80٪ من الخلايا غير شفافة وغير قابلة للانكسار.

جهاز الطرد المركزي للأنبوب عند 376 × جم لمدة ثلاث دقائق. قم بإزالة المادة الطافية تماما. أعد تعليق الخلايا برفق باستخدام مليلتر واحد من المخزن المؤقت B عن طريق سحب العينات لأعلى ولأسفل مرة إلى مرتين للخلط.

الطرد المركزي الأنبوب وإزالة المخزن المؤقت. أعد تعليق الخلايا برفق في مليلتر واحد من 70٪ من الإيثانول واحتضانها في درجة حرارة الغرفة لمدة ثلاث ونصف إلى أربع ساعات. لبدء إجراء التهجين ، قم بالطرد المركزي لأنبوب الخلايا عند 376 × جم لمدة ثلاث دقائق.

قم بإزالة 500 ميكرولتر من 70٪ من الإيثانول من الأنبوب. قم بتحريك الماصة برفق لأعلى ولأسفل لإعادة تعليق الخلايا المتبقية ونقل الخلايا إلى أنبوب منخفض الالتصاق. يعد نقل العينة إلى أنبوب منخفض الالتصاق أمرا بالغ الأهمية لمنع فقدان الخلايا الزائد أثناء غسل الفورماميد اللاحق.

الطرد المركزي أنبوب الالتصاق المنخفض وإزالة كل الإيثانول. أضف ملليلترا واحدا من محلول غسيل الفورماميد بنسبة 10٪ إلى الأنبوب وقم بالماصة برفق لأعلى ولأسفل مرتين إلى ثلاث مرات لإعادة تعليق الخلايا. اسمح للخلايا بالضبط في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة تقريبا أثناء تحضير حلول التهجين ، كما هو موضح في بروتوكول النص.

الطرد المركزي للعينة وإزالة المادة الطافية إلى نفايات خطرة. أضف ما لا يقل عن 50 ميكرولترا من كل محلول تهجين إلى الأنبوب ونفض الغبار عن الأنبوب للخلط. احتضن عند 30 درجة مئوية على أسطوانة أسطوانية لمدة 16 ساعة على الأقل في الظلام.

عند اكتمال التهجين ، ضع أنبوب الخلايا في صندوق مغطى بورق الألمنيوم للحماية من الضوء. الطرد المركزي العينة عند 376 × جم لمدة ثلاث دقائق. قم بإزالة المادة الطافية إلى نفايات خطرة عن طريق سحب العينات.

أعد تعليق العينة في مليلتر واحد من محلول غسيل فورماميد بنسبة 10٪ عن طريق سحب العينة برفق لأعلى ولأسفل مرتين إلى ثلاث مرات. ضع أنبوب الخلايا مرة أخرى في صندوق مغطى بورق الألمنيوم للحماية من الضوء واحتضانه عند 30 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. بعد 30 دقيقة ، قم بالطرد المركزي للعينة.

قم بإزالة المادة الطافية من النفايات الخطرة عن طريق سحب العينة ، مع ترك حوالي 50 ميكرولترا. أعد تعليق العينة في مليلتر واحد من محلول DAPI عن طريق سحب العينة برفق لأعلى ولأسفل مرتين إلى ثلاث مرات. مرة أخرى ، ضع أنبوب الخلايا في الصندوق المغطى بورق الألمنيوم واحتضانه عند 30 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.

الطرد المركزي للعينة وإزالة المادة الطافية تماما عن طريق سحب العينات. بالنسبة للعينات التي لن يتم تصويرها على الفور ، أعد تعليق الحبيبات في 50 ميكرولتر من المخزن المؤقت GLOX بدون إنزيمات. الماصة لأعلى ولأسفل ثلاث إلى أربع مرات للخلط.

يحفظ في الصندوق المغطى بورق الألمنيوم عند أربع درجات مئوية حتى يصبح جاهزا للتصوير. بالنسبة للعينات التي يتم تصويرها على الفور ، أضف 15 إلى 20 ميكرولترا من المخزن المؤقت GLOX مع الإنزيمات. ماصة خمسة ميكرولتر على زلة غطاء وضع زلة الغطاء على شريحة.

ضع منديلا معمليا أعلى الشريحة حيث يتم وضع زلة الغطاء. اضغط برفق على المسح لضبط الشريحة. ضع الشريحة في صندوق مغطى بورق الألمنيوم لنقلها إلى غرفة المجهر.

تم استخدام هذا البروتوكول لفحص التعبير عن جين NDC80 ، الذي يعبر عن شكلين إسويين من mRNA. يحتوي الشكل الإسوي للنسخة الطويلة غير المشفرة على 400 زوج أساسي ، خمسة امتداد أولي مقارنة بالشكل الإسوي القصير. تم تصميم مجموعتين من المجسات.

ترتبط مجموعة CF 590 بالمنطقة الأولية الخمسة الفريدة من الشكل الإسوي الطويل ، وترتبط مجموعة Q 670 بالمنطقة المشتركة لكلا الشكلين الإسوائيين. في ظل الظروف المثلى ، تم تحديد بقع smFISH المميزة بوضوح لكلتا مجموعتي المسبار. تم استخدام مجموعتي المسبار لدراسة تعبير NDC80 أثناء النمو الخضري والانقسام الاختزالي.

في الخلايا الخضرية ، تم اكتشاف إشارة قوية من مجموعة المسبار Q 670 ، ولكن ليس من مجموعة المسبار CF 590. في المقابل ، تم الكشف عن إشارة قوية من مجموعتي المسبار في الطور الانتصافي ، وكان لغالبية البقع إشارة موضعية مشتركة. أكد تحليل اللطخة الشمالية أن الشكل الإسوي الطويل تم التعبير عنه على وجه التحديد في الانقسام الاختزالي.

تم العثور على الخلايا الخضرية ليكون لها متوسط خمسة نسخ إسوية قصيرة لكل خلية ، بينما في خلايا الطور الانتصافي ، انخفض المتوسط بشكل ملحوظ إلى أربعة نسخ لكل خلية. في الطور الانتصافي ، كان متوسط عدد النصوص الإسوية الطويلة لكل خلية 21 و 100٪ من الخلايا عبرت عن النص. بمجرد إتقانها ، يمكن إجراء هذه التقنية في 72 ساعة إذا تم إجراؤها بشكل صحيح.

أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أولا تحسين مدة الهضم وتركيز مجسات smFISH المطلوبة لتحقيق نسبة الإشارة إلى الضوضاء المثلى. بالإضافة إلى ذلك ، تذكر إضافة VRC أثناء الهضم والتهجين بين عشية وضحاها لمنع نشاط النوكلياز. مع هذا التطور ، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين لاستكشاف التنظيم الديناميكي للجينات وتوطين الحمض النووي الريبي تحت الخلوي.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إجراء أسماك الحمض النووي الريبي الجزيئي الفردي في الانقسام الاختزالي للخميرة الناشئة.