الاعتداء على أساس البيوتين المنسدلة للتحقق من صحة مرناً ميرناس "الأهداف الخلوية"

يمكن أن تساعدنا هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال بيولوجيا mRNA مثل ما إذا كان هدف mRNA المتوقع في السيليكو يمكن أن يتفاعل بشكل مباشر مع microRNA خلوي معين. الميزة الرئيسية لهذه الطريقة هي أنها تستخدم تقليد البيوتينيل لسحب الرنا المرسال المستهدف. وهذه المقلدات الحيوية لها أحماض نووية مغلقة أو كيمياء تقليد قائمة على LNA مما يساعد في تكوين قليل النوكليوتيدات المستقرة للغاية ذات تقارب عال جدا يمكن أن يعزز خصوصية التفاعل.

الآثار المترتبة على هذه المنهجية هي أنها يمكن أن تستبعد من فهم بيولوجيا الحمض النووي الريبي الصغير إلى العلاجات القائمة على الحمض النووي الريبي الصغير. هذا يرجع أساسا إلى أننا نعلم جميعا أن microRNAs تلعب أدوارا حاسمة في كل جانب من جوانب البيولوجيا الخلوية. لذلك من خلال تحديد أهداف الحمض النووي الريبي الصغير ، هذه هي mRNAs ، يمكننا بالتأكيد تقديم المعرفة الهامة التي ستكون مهمة للاكتشاف والعلاج.

سيظهر البروتوكول Sabyasachi Dash ، طالب دراسات عليا من مختبرنا. لطلاء الخرزات المغناطيسية بالستربتافيدين ، أولا ، قم بتدوير الخرزات جيدا لتعليقها. بعد ذلك ، انقل 30 ميكرولترا من الخرزات المعلقة في أنبوب ميكرو فوج خال من النوكلياز بملليمترين.

اترك الأنبوب مملوءا بتعليق الخرزة المغناطيسية على المغناطيس لمدة دقيقتين. بعد دقيقتين ، قم بإزالة المادة الطافية بمساعدة ماصة دقيقة عندما يتم سحب الخرزات إلى جانب الأنبوب الملامس للمغناطيس. ثم أضف 100 ميكرولتر من مخزن الغسيل إلى الخرز.

بعد إضافة المخزن المؤقت للغسيل ، قم بإزالة الأنبوب من المغناطيس. ثم قم بتدوير الخرز لمدة 15 ثانية لغسلها. بعد ذلك ، انقل الأنبوب الذي يحتوي على الخرز المغناطيسي على المغناطيس لمدة دقيقتين.

بعد انتهاء الحضانة ، أخرج المادة الطافية وتخلص منها. ثم أضف 100 ميكرولتر من محلول تحرير RNase إلى الخرز. دوامة الخرز لمدة 15 ثانية لخلط محلول RNase.

ثم احتضان الخرز في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق. بعد خمس دقائق من الحضانة ، انقل الأنبوب الذي يحتوي على الخرز المغناطيسي على المغناطيس لمدة دقيقتين. بعد الحضانة ، قم بإخراج المادة الطافية وتخلص منها.

بعد ذلك ، أضف 100 ميكرولتر من محلول إعادة التعليق إلى الخرز ، والدوامة لمدة 15 ثانية. بعد الدوامة ، احتضان الأنبوب في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق. بعد خمس دقائق ، انقل الأنبوب بالخرز المغناطيسي على المغناطيس لمدة دقيقتين.

بعد دقيقتين ، أخرج المادة الطافية وتخلص منها. بعد ذلك ، أضف 200 ميكرولتر من محلول حجب الخرزات إلى الخرز. لإعادة تعليق الخرزات في محلول الحظر ، قم بدوامها جيدا في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 ثانية.

ثم اترك الأنبوب على محور دوار متعدد الأنابيب عند أربع درجات مئوية لمدة 16 ساعة. لتحضير المحللة ، استخدم مكشطة الخلية واكشط الخلايا HEK293T المنقولة تحت الغطاء الرقائقي. ثم انقل تعليق الخلية إلى أنبوب ميكرو فوج سعة ملليلتر.

بعد ذلك ، قم بإخضاع تعليق الخلية للطرد المركزي عند 1 ، 500 جم لمدة خمس دقائق. بعد الطرد المركزي ، قم بإذابة حبيبات الخلية في محلول ملحي مخزن بالفوسفات 1x يتم الحفاظ عليه عند درجة الحموضة 7.2. كرر عملية الطرد المركزي للحصول على حبيبات خالية من المتوسط المتبقية.

بعد انتهاء الطرد المركزي ، انقل الحبيبات بسرعة على الجليد. بعد ذلك ، قم بإعداد عازلة تحلل الخلايا الطازجة. بعد تحضير المخزن المؤقت ، أضف 260 ميكرولترا من المخزن المؤقت الكامل لتحلل الخلية إلى العينة في أنبوب الطرد الدقيق.

ماصة بيليه الخلية عدة مرات للتعليق المتجانس. لتحلل الخلايا ، احتضان الأنابيب عند 80 درجة مئوية لمدة 10 إلى 15 دقيقة. ثم اترك الخلايا على الجليد.

كرر عملية الطرد المركزي عند 16،000 جم لمدة خمس دقائق في جهاز طرد مركزي على الطاولة عند أربع درجات مئوية. بعد الطرد المركزي ، انقل المادة الطافية المحتوية على المحللة في أنبوب ميكرو فوج معقم سعة 1.7 مل على الجليد وطرد الحبيبات. أضف إلى المادة الطافية خمسة مولي كلوريد الصوديوم لتحقيق تركيز نهائي لضرس واحد.

أولا ، قم بإعداد مخزن الغسيل المنسدل. بعد حضانة ما بعد حجب الخرزة طوال الليل ، انقل الأنبوب الذي يحتوي على الخرز المغناطيسي على المغناطيس لمدة دقيقتين. تخلص من المادة الطافية بعد فترة الحضانة.

أضف إلى الخرزات 150 ميكرولتر من محلول الغسيل القابل للسحب المثلج. ثم ، قم بتدوير الخرز في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 ثانية. واحتضن على الفور في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 إلى 60 ثانية.

بعد دقيقة ، انقل الأنبوب الذي يحتوي على الخرز المغناطيسي على المغناطيس لمدة دقيقتين. تخلص من المادة الطافية بعد فترة الحضانة. بعد ذلك ، أعد تعليق الخرزات في 300 ميكرولتر من المخزن المؤقت الكامل للغسيل المنسدل.

بعد إضافة كلوريد الصوديوم ، انقل 300 ميكرولتر من محللة الخلية إلى أنبوب ميكرو فوج مملوء ب 300 ميكرولتر من الخرز. ثم اتركي الخليط على الخلاط لمدة ساعة في درجة حرارة الغرفة. بعد ساعة ، انقل الأنبوب على المغناطيس لمدة خمس دقائق.

تخلص من المادة الطافية بعد فترة الحضانة. بعد ذلك ، أضف 300 ميكرولتر من المخزن المؤقت الكامل للغسيل القابل للسحب المثلج إلى الخرز. بعد إضافة المخزن المؤقت ، قم بتدوير الخرزات لمدة 15 ثانية في درجة حرارة الغرفة.

ثم ضع الأنبوب على المغناطيس لمدة خمس دقائق. تخلص من المادة الطافية بعد فترة الحضانة. بعد ذلك ، قم بإذابة الخرزات في 100 ميكرولتر من الماء الخالي من النوكلياز ، وتخزينها على الثلج.

اعزل الحمض النووي الريبي الكلي عن الخرز. ثم قم بإذابة الحمض النووي الريبي المعزول في 25 ميكرولتر من الماء الخالي من النوكلياز. بعد ذلك ، قم بقياس تركيز الحمض النووي الريبي في مقياس الطيف الضوئي.

أخيرا ، قم بإعداد محلول مخزون العمل للحمض النووي الريبي عند 50 نانوغرام لكل ميكرولتر. بعد ذلك ، استخدم 50 نانوغراما من إجمالي الحمض النووي الريبي المعزول لتصنيع الحمض النووي المجاني باتباع تعليمات الشركة المصنعة. ثم أضف أوليغو بادئات إلى الحجم النهائي البالغ 20 ميكرولترا.

ضع أنبوب PCR على جهاز التدوير الحراري وابدأ التشغيل. بعد اكتمال qPCR ، انقل تسعة ميكرولترات من مزيج تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل في كل بئر من اللوحة. أضف إلى كل بئر ميكرولتر واحد من الحمض النووي التكميلي لتحقيق حجم نهائي يبلغ 10 ميكرولترات.

بعد ذلك ، استخدم جهاز سدادة لوحة PCR المقاوم للحرارة لإغلاق لوحة PCR وتحميلها على الدراجة الحرارية. ثم ابدأ البرنامج على الدراجة الحرارية. من أجل التحقق من صحة أهداف miR-125b ، تتم دراسة مستويات التعبير عن mRNAs المستهدفة ل PARP-1 و p53.

ومن المثير للاهتمام أن مستويات التعبير عن PARP-1 و p53 mRNAs أعلى نسبيا من Actin mRNA ، وهو التحكم السلبي. الضوابط السلبية الأخرى المستخدمة في التجربة ليست نموذجا ، وثلاثة تسلسلات رئيسية مخلوطة بيوتينيل. بالإضافة إلى ذلك ، فإن المنطقة الرئيسية الثلاث غير المترجمة من PARP-1 و p53 التي تم تحديدها كميا ، تظهر أيضا مستويات متفاوتة من التضخيم.

هذا بالمقارنة مع الضوابط السلبية ، مثل Actin ، بدون قالب ، وثلاثة تسلسلات رئيسية مخلوطة بالبيوتينيل. يشير هذا التضخيم ل PARP-1 و p53 إلى أن هذه أهداف قوية ل miR-125b الخلوية. بمجرد إتقانها ، يمكن إجراء هذه التقنية بدءا من طلاء الخلايا ، إلى نقل تقليد LNA الموسوم بالبيوتين والانتهاء بتحليل تفاعل البوليميراز المتسلسل في غضون أسبوع ، إذا تم إجراؤها بشكل صحيح.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية التحقق من صحة أهداف mRNA المفترضة في خلايا الثدييات. يمكن تحقيق ذلك من خلال نسبة عالية من الخصوصية إلى الضوضاء المنخفضة من خلال إدخال الحمض النووي المقفل الثلاثة الرئيسي الذي يحاكي التعداء القائم على خلايا الثدييات. لا تنس أن العمل مع الحمض النووي الريبي ، وخاصة الحمض النووي الريبي الصغير ، مثل الحمض النووي الريبي الصغير ، يمكن أن يكون شديد الحساسية وعرضة للتدهور.

لذلك ، يجب اتخاذ الاحتياطات اللازمة أثناء إجراء هذا الفحص ، مثل استخدام الماء الخالي من النوكلياز ، وأنابيب الطرد الدقيقة الخالية من النوكلياز ، والمخازن المؤقتة المعقمة ، ويجب مراعاة المخازن المؤقتة والكواشف المعدة حديثا أثناء إجراء هذا الاختبار للحصول على حساسية أفضل ونتائج أفضل.