التمايز، والصيانة، وتحليل خلايا ظهارة صباغ الشبكية البشرية: نموذج المرض في طبق للطفرات BEST1

يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال أمراض الشبكية المتعلقة بالقناة الأيونية حول الآليات الجزيئية لطفرات BEST1 وأمراض اعتلال الستروفيين. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تتحايل على صعوبة الحصول مباشرة على خلايا RPE من البشر. تمتد الآثار المترتبة على هذه التقنية إلى علاج اعتلال البستروبينيات ، بما في ذلك مرض بست ، حيث يمكن استخدام خلايا RPE لكل من أغراض البحث وعلاجات استبدال الخلايا.

عندما تصل ثقافة hPSC إلى التقاء ، استبدل وسط الاستزراع بأربعة ملليلتر من وسط التمايز لكل بئر من صفيحة من ستة آبار. بعد أسبوعين من الثقافة ، استكمل وسط التمايز ب 100 نانوغرام لكل مليلتر من النشط البشري ، وقم بتغيير الوسائط المكملة ثلاث مرات في الأسبوع لمدة 14 يوما أخرى. في اليوم 29 ، قم بالتبديل إلى وسط التمايز غير المكملة لمدة ثمانية إلى 10 أسابيع أخرى حتى تظهر مجموعات خلايا RPE المصطبغة.

لعزل خلايا RPE المصطبغة، ضع أولا ماصات باستور الزجاجية الفردية مقاس تسعة بوصات أفقيا فوق لهب موقد بنسن، على بعد حوالي ثلثي طول الجزء الرقيق من الماصة. عندما يصبح الزجاج الساخن ناعما ، اسحب الطرفين بسرعة لتشكيل طرف يشبه الكاشطة الدقيقة في الطرف الجديد من الماصة. رش الماصات المسحوبة بنسبة 70٪ من الإيثانول واتركها تجف في الهواء في غطاء مزرعة الخلايا.

عندما تصبح الماصات جاهزة، اغسل كل بئر من ثقافة التمايز باستخدام PBS وأضف مليلتر واحد من 0.05٪ من التربسين مع وحدة واحدة لكل ميكرولتر من الكولاجيناز إلى كل بئر. بعد 20 إلى 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية ، أوقف عملية الهضم باستخدام ملليلترين من وسط RPE بدرجة حرارة 37 درجة مئوية لكل بئر من صفيحة مكونة من ستة آبار وضع اللوحة على مرحلة المجهر. باستخدام ماصة مسحوبة، اضغط برفق على مجموعات RPE المصطبغة.

بمجرد أن تنفصل الخلايا عن قاع البئر ، استخدم ماصة دقيقة سعة 20 ميكرولتر لنقل الخلايا المنفصلة إلى آبار فردية للوحة زراعة خلية جديدة تحتوي على وسط RPE. عندما تتم إضافة ما يقرب من 5,000 خلية RPE إلى كل بئر من صفيحة 12 بئرا ، ارفع الحجم النهائي إلى ملليلترين مع وسط RPE جديد وقم بزراعة خلايا hPSC-RPE المعزولة لمدة ستة إلى ثمانية أسابيع أخرى حتى يتم ملاحظة طبقة أحادية من خلايا RPE الناضجة المصطبغة والمرصوفة بالحصى. قبل 24 إلى 72 ساعة من مشبك التصحيح ، اغسل الخلايا أحادية الطبقة المصطبغة بملليلترين من PBS ، ثم بعد إزالة PBS ، أضف ملليلتر واحد من 0.05٪ تريبسين بالإضافة إلى وحدة واحدة لكل ميكرولتر من الكولاجيناز إلى الخلايا الموجودة في كل بئر من صفيحة 12 بئرا لفترة حضانة مدتها ثماني دقائق عند 37 درجة مئوية.

عندما تبدأ الخلايا في الانفصال ، استخدم ماصة دقيقة سعة ملليلتر واحد لغسل الخلايا برفق من قاع البئر وتجميع معلق الخلية في أنبوب مخروطي سعة 15 ملليلترا. أضف ملليلترا واحدا من محلول الكولاجيناز التربسين 37 درجة مئوية إلى البئر. احتضن لمدة ثماني دقائق أخرى عند 37 درجة مئوية ، ثم اغسل أي خلايا متبقية من قاع البئر واجمع معلق الخلية في نفس الأنبوب المخروطي سعة 15 ملليلترا.

احتضان الخلايا داخل حمام جاف بدرجة حرارة 37 درجة مئوية لمدة ثماني دقائق ، ثم استخدم ماصة دقيقة سعة مليلتر واحد لتقليص الخلايا برفق من 10 إلى 15 مرة. بعد احتضان الخلايا وخلطها مرتين أخريين ، أضف خمسة ملليلتر من وسط RPE بدرجة حرارة 37 درجة مئوية إلى التعليق أحادي الخلية وحيد الخلايا وحبيبات الخلايا عن طريق الطرد المركزي. أعد تعليق الحبيبات في الحجم المناسب للبذر على ألواح مطلية مسبقا مع زلات غطاء عند التقاء 10 إلى 20٪ وقم بإجراء مشبك تصحيح الخلية بالكامل وفقا للبروتوكولات القياسية.

بعد العزل الناجح ، يجب أن ينضج أكثر من 90٪ من الخلايا في الممر الصفري لعرض مورفولوجيا خلية RPE المميزة. من خلال نهج المرض في الطبق القائم على hPSC-RPE ، يمكن تمييز كل طفرة BEST1 خاصة بالمريض بشكل شامل لتعبيرها عن البروتين ، وتهريب الأغشية ، ووظيفة القناة الأيونية للحصول على معلومات مهمة لتوضيح الآليات المرضية ل RPE. وتجدر الإشارة إلى أن بعض طفرات BEST1 قد تؤثر على تعبير البروتين ، لذلك يجب أيضا التحقق من علامات RPE الأخرى الراسخة.

يستغرق تمايز الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات من ثلاثة إلى ستة أشهر ، اعتمادا على خط الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات ونوع الطفرة ، ويمكن إكمال عزل الخلايا البشرية متعددة القدرات المتمايزة في غضون ساعتين إذا تم إجراؤها بشكل صحيح. أثناء محاولة تقسيم الخلايا لمشبك التصحيح ، من المهم أن تتذكر أن تنضج الخلايا برفق شديد لتجنب موت الخلايا الزائد. باتباع هذا الإجراء ، يمكن إجراء طرق أخرى مثل زراعة خلايا RPE ثلاثية الأبعاد للإجابة على أسئلة إضافية حول كيفية تأثر نقل الأيونات على الأغشية القمية والقاعدية لخلايا RPE بطفرات BEST1.

بعد تطويرها ، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال الأمراض التنكسية للشبكية لاستكشاف الأنماط الظاهرية الفسيولوجية والآليات المرضية لخلايا RPE المشتقة من المريض. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تمييز الخلايا الجذعية متعددة القدرات إلى خلايا ظهارة صبغية الشبكية وإعداد خلايا RPE لمشبك التصحيح للخلية الكاملة.