تعريف النشاط وصي ينظم الأكسدة والاختزال في Hsp33 وتعيين التغييرات كونفورماشونال في Hsp33 باستخدام الهيدروجين الديوتريوم التبادل الكتلي

يمكن أن يساعد سير العمل المقدم هنا في توسيع فهمنا للدور الخلوي للمرافقين أثناء ظروف الإجهاد التأكسدي. على وجه التحديد ، يمكن أن يساعد في فهم كيف يمنع المرافقون تراكم البروتين أثناء الظروف التي تتكشف بالنسبة لهذين الظهرين من التقنيات المختلفة ، توفر نظرة ثاقبة لنشاط المرافقين المنفصلين عن العلم.

يمكن استخدامه أيضا لدراسة البروتينات الأخرى للتفاعل مثل التفاعلات الاجتماعية للإنزيم وديناميكيات البروتين. يعد العرض المرئي لهذه الطريقة أمرا بالغ الأهمية لأنه يتضمن استخدام أدوات مختلفة قد تكون صعبة للمستخدمين الجدد. أولا ، قم بتدوير عينة بروتين مذابة مسبقا لإزالة الركام.

ثم أضف خمسة مللي مولار DTT و 20 ميكرومولار كلوريد الزنك واحتضان العينة لمدة 1.5 ساعة على الأقل عند 37 درجة مئوية. لإزالة DTT ، قم بموازنة عمود تحلية مع مخزن مؤقت لفوسفات البوتاسيوم 40 ملليمولار عن طريق ملء العمود بالكامل بالمخزن المؤقت وتركه يقطر. باستخدام ملاقط ، اضغط برفق على مرشح القرص الأبيض في العمود وقم بإزالته.

أعد ملء العمود بمخزن فوسفات البوتاسيوم وجهاز الطرد المركزي عند 1000 مرة G لمدة ثلاث دقائق. بعد الطرد المركزي ، انقل العمود إلى أنبوب نظيف وأضف عينة البروتين ببطء إلى منتصف العمود. قم بالطرد المركزي للعمود عند 1000 مرة G لمدة دقيقتين بحيث يكون البروتين الخالي من DTT في التدفق.

تحقق الآن من تركيز البروتين وقم بقياس امتصاصه عند 280 نانومتر. وزع نصف عينات البروتين في حصص. احتضان الحصص في ظروف لاهوائية لمدة 20 دقيقة لإزالة الأكسجين بالكامل.

ثم أغلق الأنابيب بغشاء بلاستيكي وقم بتخزين العينات في ظروف باردة. بعد ذلك ، أضف خمسة مللي مولار بيروكسيد هيدروجين محضر حديثا إلى عينة البروتين المتبقية واحتضنه لمدة ثلاث ساعات عند 40 درجة مئوية أثناء الرج. بعد الطرد المركزي ، تحقق من تركيز البروتين ثم قسم البروتينات المؤكسدة إلى حصص وقم بتخزينها في ظروف باردة.

قم بإعداد الركيزة المشوهة عن طريق احتضان 12 سينسيز سترات ميكرومولار طوال الليل في 40 ملليمولار هيبس و 4.5 مولي كلوريد جوانيدينيوم. في اليوم التالي ، افتح برنامج مقياس الطيف الفلوري وانتقل إلى قياس الدورة الزمنية. اضبط عرض النطاق الترددي للإثارة على 2.5 نانومتر.

الطول الموجي للإثارة إلى 360 نانومتر. الطول الموجي للانبعاث يصل إلى 360 نانومتر. عرض النطاق الترددي للانبعاث يصل إلى خمسة نانومتر.

والفاصل الزمني للبيانات يصل إلى 0.5 ثانية. اضبط درجة الحرارة على 25 درجة مئوية. تحضير العينة بإضافة 1600 ميكرولتر من 40 مللي مولار HEPES إلى كوفيت الكوارتز.

أدخل الكوفيت في حامل عينة مقياس الطيف الفلوري مما يسمح للعينة بالوصول إلى درجة الحرارة المطلوبة. بعد ضبط التقليب على 600 دورة في الدقيقة ، ابدأ القياس حتى يتم تحديد خط الأساس. لقياس تراكم سينسيز السترات في حالة عدم وجود مرافق ، أضف 10 ميكرولترات من سينثيتاز السترات المشوهة ، بعد 120 ثانية من القياس.

ثم استمر في القياس لمدة 1200 ثانية. لقياس تراكم سينسيز السترات في وجود Hsp33 ، أضف Hsp33 60 ثانية في القياس. بعد 60 ثانية إضافية ، أضف 10 ميكرولترات من سينثيتاز السيترات المشوهة واستمر في القياس لمدة 1200 ثانية.

بعد ذلك ، قم بتحميل ملف البيانات لإجراء تحليل البيانات وإزالة الضوضاء بواسطة Kfits. لإزالة أي ضوضاء ، اختر معلمات التحليل ، استخدم أفضل نموذج تلقائي وحدد الضوضاء دائما فوق الإشارة. قم بإزالة القيم المتطرفة الواضحة يدويا باستخدام الخطوط القابلة للتعديل باللونين الأخضر والأحمر والتي ستقوم بتصفية الضوضاء فوق الخط الأخضر وأسفل الخط الأحمر.

بعد ذلك ، قم بتعيين خط الأساس ومنحنى الملاءمة. بعد تطبيق حد الضوضاء، قم بتنزيل البيانات المعالجة. قم بإعداد عينات معقدة من ركيزة البروتين عن طريق إضافة سينثيتاز السترات إلى Hsp33 بنسبة 1 إلى 1.5 عند 43 درجة مئوية.

استخدم أربع خطوات على الأقل واحتضن العينات لمدة 15 دقيقة عند 43 درجة مئوية بعد كل إضافة للسماح بالتكوين المعقد. الطرد المركزي للعينات عند 16000 مرة G عند أربع درجات مئوية لمدة 30 دقيقة لإزالة أي ركام. ثم ضع العينات في حشوات زجاجية سعة 150 ميكرولتر وانقلها إلى قوارير.

ثم ضعها في الصواني المناسبة. أمسك المخازن المؤقتة H و D عند 25 درجة مئوية واحتفظ بالعينات ومخزن التبريد عند صفر إلى درجتين مئويتين. بعد ذلك ، قم بتشغيل جميع وحدات التبريد في مطياف الكتلة يدويا.

بمجرد أن تصل جميع أنظمة التبريد إلى درجات الحرارة المستهدفة ، قم بتشغيل كل من HPLC ومضخات التحميل يدويا. افتح البرنامج الذي يتحكم في كل من المضخات بالإضافة إلى البرنامج الذي يتحكم في مطياف الكتلة وتأكد من أن MS في وضع الاستعداد. بعد ذلك ، افصل صمام مخرج HPLC عن مصدر MS.

اغسل النظام أولا بمحلول منظف ثلاثي. ثم مع المخزن المؤقت B وأخيرا مع المخزن المؤقت A.ثم أدخل عمود البيبسين في النظام. بعد غسل النظام بتدفق ثابت وضغط ثابت ، أدخل صمام مخرج HPLC في مصدر MS وقم بتشغيل MS.

الآن افتح البرنامج. قم بإنشاء تسلسل تشغيل وأدخل جميع النقاط الزمنية وأسماء العينات والمواقع في الأدراج بالإضافة إلى أسماء المخزن المؤقت والمواقع. بعد اكتمال التشغيل ، قم بتحليل تغطية الببتيد للعينة عن طريق تشغيل عينات التحكم غير الديوتيرتيد من خلال البرنامج.

انقل البيانات إلى برنامج HDX Workbench وحلل النتائج باستخدام البرنامج. احفظ الببتيدات المختارة واستمر في تحليل امتصاص الديوتيريوم. يؤدي التمسخ الكيميائي إلى تراكم سريع لسينثيتياز السترات الناجم عن إعادة طي بروتين متمسخ بالكامل في ظروف عازلة غير مواتية.

من ناحية أخرى ، ينتج التجميع الناجم عن الحرارة من انكشاف بطيء نسبيا للركيزة المطوية أصلا. في كلا الشكلين من التمسخ ، ألغت إضافة Hsp33 المؤكسد التجميع تماما ، مما أدى إلى خفض قراءات 360 نانومتر إلى قيم ضئيلة. لم يكن لوجود Hsp33 المنخفض أي تأثير على استقرار سينثيتياز السترات وأعطى منحنى تجميع مشابه للمنحنى المكتشف في حالة عدم وجود مرافق.

يكشف نمط التثنيط بين المرافق المرتبط وغير المرتبط Hsp33 إلى تركيبة سترات الركيزة عن موقع تفاعل العميل داخل مجال تبديل الأكسدة والاختزال الطرفي C للمرافق. يحتوي Hsp33 المخفض على بنية منظمة تماما ولكنه يصبح وظيفيا عندما يستشعر الإجهاد التأكسدي. في حين أن Hsp33 المحدود وغير المرتبط ينتج منحنيات ببتيد متشابهة ، فإن Hsp33 المؤكسد يظهر فرق ديوتري بنسبة 30٪ بين المرافق المرتبط وغير المرتبط ، مع مناطق معينة من البروتين المرتبط ، مما يشير إلى وجود عائق خيفي.

بمجرد إنشائها ، يمكن إكمال مقايسة التشتت في غضون ساعات قليلة بينما يمكن إكمال منهجية DHEX في غضون يومين إلى أربعة أيام إذا تم إجراؤها بشكل صحيح. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم التخطيط للمستقبل. تذكر أن الحالة الموصوفة مثل درجة الحرارة وأوقات الحضانة والمحاليل العازلة خاصة بالبروتين ويجب تحسينها لكل بروتين.

باتباع هذا الإجراء ، يمكن تنفيذ منهجيات أخرى مثل الربط المتقاطع أو هطول الأمطار من أجل استكمال دراسات تفاعلات ركائز المرافقة. في الختام ، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال البيولوجيا الهيكلية لاستكشاف مرونة البروتين في المرافقين الجزيئيين.