طريقة تعيين النسخة متماثلة: نهج الفائق "قياس كمي" ايليجانس كاينورهابديتيس عمر

تم تحديد مئات الجينات التي تؤثر وظيفتها على كيفية شيخوخة الكائن الحي. لكن العديد من علاقاتهم غير مفهومة جيدا. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على سؤال رئيسي في مجال الشيخوخة.

وهي ما هي العلاقات الجينية بين جينات gerA؟ الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي زيادة الإنتاجية ، حيث يتم زيادة عدد المقدمات الجينية التي يمكن قياسها كميا في وقت واحد بترتيب من حيث الحجم على الأقل. يمكن رسم بيانات العمر الافتراضي التي تم جمعها باستخدام هذا الإجراء وتحليلها باستخدام البرامج التي نقدمها مع هذا المنشور.

بالإضافة إلى توفير نظرة ثاقبة للعمر ، يمكن أيضا تطبيق هذه الطريقة على الأنماط الظاهرية الأخرى المرتبطة بالعمر ، مثل مقاومة الإجهاد والتغييرات في الخطة الصحية. لهذا الإجراء ، قم بإنشاء طابع جديد لمكتبة RNAi الفرعية. أولا ، قم بتقطيع كل بئر من صفيحة 96 بئرا ، مع 200 ميكرولتر من LB مع أمبيسلين ، باستخدام ماصة ذات 12 قناة.

قم بتعقيم مكرر الألواح المكون من 96 سنا عن طريق غمر المسامير بالتتابع في مبيض بنسبة 50٪ متبوعا بماء نقي للغاية. ثم اغمس النصائح في الإيثانول ، وقم بإشعال النصائح بعناية. بعد ذلك ، قم بإزالة غطاء الرقائق اللاصقة بعناية للوحة مكتبة مخزون الجلسرين المجمدة المكونة من 96 بئرا ، وطحن أطراف مكرر الألواح المعقمة برفق ولكن بحزم في آبار مخزون الجلسرين الذي لا يزال مجمدا.

ثم قم بتلقيح الثقافات وختم اللوحة الملقحة بالغشاء النفاذ. اسمح للثقافات بالنمو بين عشية وضحاها على سطح المقعد. في اليوم التالي ، قم بتعقيم مكرر الألواح ، وقم بإزالة الختم بعناية من الثقافة الليلية ، واغمر أطراف دبابيس النسخ المتماثل.

بعد ذلك ، قم بتلقيح أمبيسلين LB مستطيل ولوحة أجار التتراسيكلين بالمسامير. ضع ضغطا متساويا ، واستخدم حركة دائرية صغيرة لنقل البكتيريا دون ترك البقع مزدحمة للغاية. ثم احتضن الصفائح طوال الليل عند 37 درجة مئوية.

في اليوم التالي ، مقابل كل 10 لوحات طبق الأصل مطلوبة ، قم بتحميل كل بئر من صفيحة 96 بئرا عميقة الآبار ب 1.5 مل من LB مع الأمبيسلين. بعد ذلك ، قم بتلقيح الآبار بالبكتيريا المستزرعة. ثم أغلق اللوحة بغشاء مسامي ، وزرعها لمدة 20 ساعة مع الرج.

يجب أن تكون آبار التحكم منتشرة عبر 96 بئرا ، بحيث عندما يتم تقسيم لوحة المكتبة الفرعية المكونة من 96 بئرا إلى مجموعات من 24 ، فإن كل قسم من 24 بئرا له واحد من كل من عناصر التحكم. في اليوم التالي، قم بتحميل 120 ميكرولتر من المزرعة، إلى الألواح المكونة من 24 بئرا، باستخدام ماصة متعددة القنوات سداسية الآبار، مع تباعد أطراف قابل للتعديل. بعد ذلك ، يتم الكشف عن الألواح الجافة في غطاء التدفق الصفحي حتى يتم امتصاص كل السائل.

لا تدعهم يجفوا. تأكد من الحفاظ على تركيزك عند نقل المزارع السائلة ، للتأكد من وضع الثقافة البكتيرية المناسبة في البئر المناسب في اللوحة المكونة من 24 بئرا. تبدأ تجارب مجموعة النسخ المتماثلة بمجموعة من الألواح المستقلة المكررة المكونة من 24 بئرا ، كل منها مصنف بنفس استنساخ RNAi للبكتيريا.

بالنسبة لتجارب العمر الافتراضي ، تتم إضافة 15 إلى 20 L1 إلى كل طبق جيدا ، ويسمح لها بالنمو إلى المرحلة L4. في L4 ، تتم إضافة FUdR إلى جميع الآبار عبر التكرارات. في وقت لاحق من نفس اليوم ، يمكن أخذ لوحة مكررة من المجموعة وتسجيلها كنقطة زمنية أولى.

لتسجيل العمر الافتراضي ، يضاف السائل إلى آبار الصفيحة للحث على حركة. يتم حث التي لا تبدأ في الحركة برفق باستخدام معول دودة. ثم يتم تسجيل العدد الإجمالي للحيوانات وعدد النافقة.

ثم يتم التخلص من اللوحة من الملاحظة الأولى. في النقطة الزمنية التالية للمراقبة ، يتم أخذ لوحة تكرار أخرى من المجموعة ، ويتم تسجيلها بطريقة مماثلة. يتكرر هذا في فاصل التسجيل المحدد.

في كل مرة مع لوحة جديدة من مجموعة النسخ المتماثل. استمر في تسجيل مجموعة من اللوحات حتى لا تبقى أي على قيد الحياة. أولا ، قم بمزامنة مجموعة من بنفس طريقة الإعداد القائمة على التبييض المستخدمة في مقايسة العمر التقليدية.

بعد ذلك ، باستخدام ماصة تباعد قابلة للتعديل بستة آبار ، وخزان كاشف ، قم بزرع 15 إلى 20 L1 في كل بئر من الألواح المعدة المكونة من 24 بئرا. أثناء بذر الصفائح ، قم بخلط L1 بشكل دوري في محلول للحفاظ على التوزيع المتساوي. الآن ، دع تتطور إلى L4. يجب أن يكون توقيت تطوير L4 معروفا لهذا البروتوكول.

مراقبة تطور الديدان بشكل دوري. عندما تصل إلى L4 ، أضف 24 ميكرولترا من 50x FUdR إلى كل بئر ، وأعد الأطباق إلى الحاضنة. يعد استخدام L4 أمرا بالغ الأهمية.

إذا وصلت الخنثى إلى مرحلة النضج الإنجابي قبل إضافة FUdR ، فستبقى ذريتها على قيد الحياة وتأكل الطعام. على العكس من ذلك ، فإن إضافة FUdR في وقت مبكر جدا يؤدي إلى تمزق. في النقاط الزمنية المطلوبة ، استخدم لوحة واحدة مكررة لتسجيل الجدوى.

للقيام بذلك ، قم بإغراق البئر بمحلول M9. قبل تسجيل الجدوى كل يوم ، قم بمسح أي آبار لا تحتوي على طعام ، أو تبدو ملوثة ، أو بها بها عيوب مورفولوجية أو تنموية. لكل بئر ، سجل إجمالي لكل بئر ، وتحقق من حالة الديدان غير المتحركة ، عن طريق لمس كل منها برفق على رأسها باستخدام معول دودة.

بعد عد جميع الموتى غير المتحركين في طبق ، تخلص من اللوحة. لهذا الإجراء, تنمو تحولت ه. القولونية بين عشية وضحاها في LB مع الأمبيسلين.

في اليوم التالي ، قم بتركيز البكتيريا عن طريق الطرد المركزي عند 3000 جرام لمدة 15 إلى 20 دقيقة. أعد تعليق البكتيريا في 1/10 من حجم البداية. بعد ذلك ، قم بنقل 200 ميكرولتر من البكتيريا 10x على ألواح يبلغ طولها ستة سنتيمترات.

قم بإعداد ثلاث أو أربع أطباق لكل حالة اختبار ، وقم بتضمين لوحين إضافيين في حالة التلوث. جفف الألواح في دفعة تدفق رقائقي ، حتى يتم امتصاص كل السائل أو تبخره. بمجرد أن تجف ، قم بتخزين الأطباق في صندوق بلاستيكي طوال الليل في درجة حرارة الغرفة للحث على إنتاج الحمض النووي الريبي مزدوج الشريطة.

ثم قم بتخزين الأطباق لمدة تصل إلى أسبوعين عند أربع درجات مئوية. بالنسبة للحيوانات ، اجمع البالغة في M9. اغسلهم مرتين باستخدام M9. تكرار الدوران في الطموح. بعد ذلك ، أعد تعليق C.elegans في أربعة ملليلتر من M9 ، وأضف ملليلترين من محلول هيبوكلوريت.

الآن ، قم بدوامة الديدان على الفور لمدة ثلاث دقائق ، مع اهتزاز دوري قوي. ثم ، تحت مجهر تشريح ، ابحث عن سحابة من البيض. إذا لم يتم رؤية السحابة ، فقم بتدوير الديدان لمدة 10 إلى 20 ثانية إضافية.

بعد ذلك ، اغسل البيض بسرعة باستخدام M9 ، مرتين ، كما كان من قبل. وأعد تعليق البيض المغسول في ثلاثة ملليلتر M9. بعد ذلك ، انقل البيض إلى أنبوب جديد سعة 15 مليلتر ، واحتضن الأنبوب عند 20 درجة مئوية مع دوران لطيف ، واترك الأجنة تفقس طوال الليل. في اليوم التالي ، حدد كثافة محلول L1 المحضر عن طريق حساب متوسط عدد L1s لكل ميكرولتر في ثلاث قطرات سعة 10 ميكرولتر.

قم بتحميل ألواح البكتيريا المحضرة ب 50 L1 لكل منها. قم بإعداد الألواح في حاضنة 20 درجة مئوية ، حتى تتطور الأجنة إلى المرحلة L4. يستغرق التطور الطبيعي من L1 إلى L4 حوالي 40 ساعة.

بعد ذلك ، لمنع إنتاج النسل ، أضف 160 ميكرولترا من 50x FUdR إلى كل لوحة. ثم قم بإزالة الذكور ، حيث يتم قياس العمر عادة فقط باستخدام الخنثى. بمجرد الانتهاء ، أعد تعبئة الألواح في حاضنة 20 درجة مئوية.

حتى تموت جميع الديدان ، سجل قدرتها على البقاء على أساس يومي. للقيام بذلك ، المس برفق كل ديدان خيطية غير متحركة على الرأس بسلك بلاتيني أو رمش. غير المتفاعلة ميتة ، ويجب إزالتها من اللوحة.

لاحظ أي حالات شاذة خلال هذا الروتين. تنتج مجموعة النسخ المتماثلة والطرق التقليدية لفحص عمر C.elegans نتائج مماثلة مع N2 من النوع البري. على سبيل المثال ، أدت ضربة قاضية RNAi القائمة على التغذية ل mml-1 أو mxl-2 إلى تقليل العمر الطبيعي بشكل كبير.

تم قياس ذلك من خلال كل من مقايسة العمر التقليدي ، ومقايسة مجموعة النسخ المتماثلة. يمكن أيضا الكشف عن طول العمر الممتد. كما رأينا هنا ، زاد RNAi ل mdl-1 أو mxl-1 بشكل كبير من عمر C.Elegans عند قياسه بأي من المنهجيتين.

باستخدام طريقة مجموعة النسخ المتماثلة ، من الممكن تحديد التغيرات في العمر عبر أكثر من 100 حالة في وقت واحد ، وهو ما لن يكون معقولا مع نهج أكثر تقليدية. على سبيل المثال ، حددت شاشة RNAi القائمة على التغذية على مستوى الجينوم 159 جينا ضروريا لزيادة العمر الافتراضي الممنوح عن طريق تقليل الإشارات الشبيهة بالأنسولين daf-2. تم وصف العلاقة بين الإشارات الشبيهة بالأنسولين وهذه الجينات بشكل أكبر عن طريق قياس الامتداد الصحي للحيوانات.

تمت الإشارة إلى الصحة بواسطة ج. Elegans يسحق عند تعليقه في المحلول. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية استخدام الحمض النووي الريبي القائم على التغذية لقياس عمر C.Elegans.

لكن الحمض النووي الريبي متعدد الاستخدامات ويمكن تطبيقه على العديد من الأنماط الظاهرية المختلفة. بمجرد إتقانها ، تسمح طريقة مجموعة النسخ المتماثلة بتقييم العمر الافتراضي لأكثر من 100 نسخة من RNAi كل يوم ، إذا تم إجراؤها بشكل صحيح. يمكن تسجيل نقاط الوقت المبكر والمتأخر بسرعة.

ستكون جميع في البئر إما حية ومتحركة أو ميتة. يستغرق التسجيل وقتا أطول عندما تبدأ في الموت. أرجع إعداد المحاكمات المستقلة مع وضع ذلك في الاعتبار.