في الموقع القياس والعلاقة بين كثافة الخلية وانبعاث الضوء من البكتيريا طرحه

يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال التلألؤ الحيوي. مثل إيجاد ظروف النمو المثلى لأقصى كثافة للضوء للبكتيريا الحيوية وتحديد الآلية التنظيمية. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي الإعداد السهل ، والذي يمكن استخدامه لمختلف السلالات والكائنات الحية ، فضلا عن إمكانيات الضبط البسيطة والسريعة.

يمكن أن يوفر اتباع هذه الطريقة نظرة ثاقبة لخصائص أوبرون لوكس. يمكن تطبيقه أيضا على أنظمة أخرى ، مثل البكتيرية أو البيئية أو أنظمة الإبلاغ أو أجهزة الاستشعار. للبدء ، قم بإعداد ثقافة بين عشية وضحاها عن طريق تلقيح 100 مل من وسط LB بالكاناميسين ، باستخدام أوبرون لوكس الذي تم تحويل خلايا الإشريكية القولونية BL21 من مخزون الجلسرين ، أو مباشرة من لوحة التحول.

احتضان الثقافة عند 37 درجة مئوية و 120 دورة في الدقيقة بين عشية وضحاها. في اليوم التالي ، قم بتلقيح 800 مل من وسط LB kanamycin مع 8 مل من الثقافة الليلية. احتضان المزرعة عند 37 درجة مئوية ، و 120 دورة في الدقيقة في شاكر حاضنة ، حتى تصل كثافة الخلية إلى OD600 من 0.6 إلى 0.8.

خفض درجة حرارة الحضانة إلى 28 درجة مئوية ، وتحفيز التعبير عن البروتين عن طريق إضافة 0.1 مللي مولار IPTG. ثم راقب الخلايا حتى تبدأ في التألق. بعد تحضير الوسائط وفقا لبروتوكول النص ، قم بربط السلالات البكتيرية المضيئة بيولوجيا على ألواح أجار متوسطة مياه البحر الاصطناعية ، واحتضانها عند 24 إلى 30 درجة مئوية بين عشية وضحاها.

قم بإعداد ثقافة ليلية عن طريق تلقيح 100 مل من وسط مياه البحر الاصطناعي بمستعمرة واحدة من اللوحة. ثم احتضان المزرعة عند 24 إلى 30 درجة مئوية و 120 دورة في الدقيقة بين عشية وضحاها. في اليوم التالي ، قم بتلقيح 800 مل من وسط مياه البحر الاصطناعي مع 8 مل من الثقافة الليلية.

احتضان الخلايا البكتيرية عند 24 إلى 30 درجة مئوية و 120 دورة في الدقيقة وراقب الخلايا حتى تبدأ في التألق. قم بربط السلالة البكتيرية المضيئة بيولوجيا المرغوبة ، أو سلالة الإشريكية القولونية المعدلة على صفيحة أجار ، واحتضان المزرعة عند 28 درجة مئوية بين عشية وضحاها. تلقيح 3 مل من الوسط بمستعمرة واحدة من الصفيحة الليلية ، واحتضان الخلايا عند 28 درجة مئوية و 180 دورة في الدقيقة لمدة ساعة إلى ساعتين تقريبا.

قم بقياس كثافة الخلية لتخفيف من واحد إلى عشرة للثقافة السائلة عند 650 نانومتر. ثم احسب نسبة وحجم مليلتر واحد من الثقافة ب OD650 0.05. الماصة الحجم المحسوب للثقافة والوسط في صفيحة سوداء الجدران 24 بئر مع قاع زجاجي.

للتأكد من أن متجه pET28a الذي يحتوي على أوبرون لوكس بأكمله لا يضيع ، والذي يتم التعبير عنه في سلالة الإشريكية القولونية المعدلة ، أضف ميكرولتر واحد من الكاناميسين ، وميكرولتر واحد من IPTG إلى العينات. ثم ضع غطاءا على الطبق لتجنب التبخر أثناء القياسات. أخيرا ، استخدم قارئ الألواح الذي تم ضبطه على 28 درجة مئوية ونصا موجودا في بروتوكول النص ، لأخذ قياسات الامتصاص والتلألؤ البيولوجي كل 10 دقائق ، مع الاهتزاز بين نقاط البيانات.

يقارن هذا الشكل قياسات OD650 لخلايا الإشريكية القولونية BL21 ، وخلايا BL21 التي تحتوي على متجه pET28a فارغ ، وخلايا BL21 التي تحتوي على متجه pET28a مع إدراج عامل lux-rib ، ولكن بدون تحريض. تظهر جميع القياسات المرجعية الثلاثة لانبعاث الضوء منحنى نمو سيني مع مراحل نمو متأخرة وأسيا وثابتة ، ولكن لا يوجد انبعاث ضوئي ، باستثناء العينة الأخيرة ، التي تظهر انبعاث الضوء بعد 300 دقيقة ، بسبب تسرب محفز T7. هنا ، تمت مقارنة منحنيات النمو وشدة الضوء لأوبرون لوكس المعبر عنها في الإشريكية القولونية ، والسلالة البكتيرية المضيئة بيولوجيا ، البكتيريا الضوئية mandapamensis 27561 ، عند 28 درجة مئوية في LB ، أو وسط مياه البحر الاصطناعي.

تنمو سلالة الإشريكية القولونية المعدلة و P.mandapamensis في وسط مياه البحر الاصطناعي ، وكذلك وسط LB ، وكلاهما يظهر انبعاثا ضوئيا. لكن في وسط LB ، P.Mandapamensis لا ينبعث منه الضوء على الإطلاق. من اللافت للنظر أن سلالة الإشريكية القولونية المعدلة تظهر شدة ضوء قصوى أعلى من البكتيريا المضيئة بيولوجيا.

في هذه التجربة ، تم قياس التعبير الجيني لأوبرون لوكس الضلع القائم على الإشريكية القولونية على مدار 24 ساعة لتحليل طول عمره. استمر انبعاث الضوء لمدة 19 ساعة ونصف ، وهو أطول بكثير من السلالات البكتيرية ، حيث لوحظ انخفاض تدريجي ، مما أدى إلى انبعاث ضوء منخفض للغاية بعد 10 ساعات. بعد تطويرها ، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال التلألؤ البيولوجي لاستكشاف مشغلات لوكس في الكائنات الحية النموذجية ، مثل الإشريكية القولونية.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية التعامل مع البكتيريا المضيئة بيولوجيا.