منصة ميكروفيسيولوجيك للدهون البشرية: تقع في الأنسجة الدهنية البيضاء

تسمح لنا هذه الطريقة المتقدمة ، لأول مرة ، بالحفاظ على الدهون حية وصحية خارج الجسم الحي لعدة أسابيع متتالية لدراسة بيولوجيا الدهون. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أن الأنسجة تظل مستقرة على مدى ثمانية أسابيع في الثقافة مع تلخيص البيئة المكروية الدهنية بما في ذلك خلايا الدعم اللحمية الدهنية الأصلية المحيطة. ابدأ ببذر ASC عند التقاء 80٪ تقريبا في ألواح زراعة الأنسجة.

لكل بئر من SWAT المطلوب ، قم بزرع بئر ثقافة أنسجة تقليدية وبئر واحد بالحجم المقابل على لوحة بلاستيكية لزراعة الأنسجة المطلية ب PNIPAAm. حافظ على ASC في وسط استزراع كامل عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2 لمدة ستة إلى ثمانية أيام ، مع تغيير الوسط كل يومين. قبل أربع وعشرين ساعة من بذر SWAT ، قم بلف حافة قرص المكبس لكل مكبس لجهاز البذر SWAT مرتين على الأقل بشريط مختبر لمنع تسرب محلول الجيلاتين.

في خزانة السلامة الحيوية المطهرة بالإيثانول ، قم برش رف أنبوب مخروطي سعة 15 مليلتر يحتوي على أنابيب مخروطية فارغة غير مغطاة سعة 15 مليلتر ، بالإضافة إلى كل مكبس ملفوف بشريط يحتوي على 70٪ من الإيثانول ، ووضع كل مكبس في أنبوب فارغ أثناء تطهيره. رش ما يقرب من 6.3 جرام من الغسالات المعدنية وضعها على الرف مع زوج من الملقط المعقوف. ثم أغلق وشاح الخزانة وقم بتشغيل ضوء الأشعة فوق البنفسجية لتسهيل التجفيف والتعقيم طوال الليل لمواد جهاز البذر.

عندما تصل الخلايا إلى التقاء 100٪ وتظهر نمطا مخططا ، أضف 0.75 جرام من مسحوق الجيلاتين إلى 10 ملليلتر من HBSS. وتوازن درجة الحموضة في المحلول مع 100 ميكرولتر من هيدروكسيد الصوديوم. أضف الجيلاتين إلى حمام مائي بدرجة حرارة 75 درجة مئوية ورج الأنبوب بقوة كل خمس دقائق حتى يذوب المسحوق في المحلول.

صفي محلول الجيلاتين المتجانس من خلال مرشح حقنة وضعي الجيلاتين على المكطاسات. ستكون الحواف المسجلة للغطاسات بمثابة قالب بينما يتجمد الجيلاتين. عندما يصلب الجيلاتين ، قم بفك غلاف الشريط واستخدم الملقط المعقوف لإزالة الجيلاتين من الحافة الخارجية للمكبس ، مع الحرص على أن يكون الجيلاتين المتبقي في وسط المكبس مستويا تماما ، لزيادة التلامس مع ورقة ASC.

بمجرد إزالة الجيلاتين من جميع الغطاسات ، ضع كل مكبس برفق على لوحة ASC مطلية ب PNIPAAm باستخدام الغسالات المعدنية لوزن المكتاسات. بعد حضانة لمدة 1.5 ساعة في درجة حرارة الغرفة ، انقل الألواح إلى حمام ماء مثلج لمدة 1.5 ساعة أخرى لإكمال تفكك ورقة الخلية عن سطح اللوحة المطلية ب PNIPAAm. بعد ذلك ، قم بتنظيف الجزء السفلي من الألواح المطلية ب PNIPAAm لإزالة أي ماء غير معقم.

عند استلام الأنسجة الدهنية البشرية ، أضف وسط زراعة الخلايا الباردة إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 مليلتر لكل مزرعة ليتم زرعها. وغسل أجزاء كبيرة من الأنسجة الدهنية ثلاث مرات في PBS معقم ، وإزالة أكبر قدر ممكن من PBS بين الغسل. بعد الغسيل الأخير ، استخدم الملقط وشفرة الحلاقة المعقمة لفرم الأنسجة بشكل خشن ، وإزالة أكبر قدر ممكن من الأوعية الدموية واللفافة حتى يأخذ المحلول قواما سائلا سميكا مع أقل عدد ممكن من الأجزاء الفردية المرئية من الأنسجة الدهنية البيضاء.

بمجرد الوصول إلى تناسق الأنسجة المناسب ، استخدم طرف ماصة دقيقة معدلة P1000 لنقل الحجم المناسب من الأنسجة المفرومة إلى كل أنبوب 1.5 مليلتر معد مسبقا وخلط الأنسجة المفرومة لفترة وجيزة مع الوسط داخل الأنابيب. بعد ذلك ، استبدل الوسط في كل ثقافة ASC بحجم واحد من محلول الأنسجة الدهنية البيضاء ، وانقل غطاسات الجيلاتين برفق إلى خليط الأنسجة الدهنية البيضاء على ألواح ASC الأساسية. افحص الطبقات الأحادية في الألواح المطلية ب PNIPAAm تحت المجهر لتأكيد الانفصال الخلوي ونقل الألواح إلى سطح كتلة حرارية من 37 إلى 40 درجة مئوية في خزانة السلامة الحيوية.

ثم أضف ملليلترين إلى ثلاثة ملليلترات من وسط الثقافة الدافئة لاحتضان الخلايا وتسهيل ذوبان الجيلاتين. بعد 30 دقيقة ، قم بإزالة الغطاسات برفق من سطح اللوحة ، وقم بتغطية المزارع بأغطية الألواح المناسبة وضع الألواح في حاضنة زراعة الخلايا. عندما يصبح الجيلاتين سائلا تماما ، قم بشفط واستبدال وسط زراعة الخلية بالحجم المناسب من وسط M199 الخالي من الفينول الأحمر المكمل بالأنسولين والديكساميثازون والمضادات الحيوية.

على مدار 7.5 أسابيع من الثقافة ، تظل مجموعات SWAT مثبتة في مكانها على الطبقة الأحادية مع ملاحظة تغييرات مورفولوجية طفيفة فقط في الخلايا الشحمية الفردية. يوضح تلطيخ النيل الأحمر الصافي لمجموعات الخلايا الشحمية أحادية الموقع في أسبوعين من الثقافة أن الخلايا هي بالفعل خلايا شحمية ذات أغشية سليمة ، بدلا من القطع الأثرية أو الخراجات أو الخلايا الشحمية الميتة. يؤكد تلطيخ يوديد البروبيديوم ل SWAT البالغ من العمر 53 يوما وتلوين الزيت الأحمر O لمزارع SWAT البالغة من العمر 51 يوما أن الخلايا الشحمية تحافظ على قابليتها للحياة حتى في النقاط الزمنية المتقدمة.

توضح الكيمياء الخلوية المناعية التعبير المناسب المتوقع للبروتين وتوطين علامات الخلايا الشحمية الناضجة داخل SWAT ويشير تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي إلى التعبير عن جينات الخلايا الشحمية الرئيسية على مستوى النسخ. يشير تقييم وظيفة الغدد الصماء في الريحان إلى إفراز الريحان اللبتين من مزارع SWAT كما تم اكتشافه بواسطة ELISA ، كما يمكن تحفيز إطلاق الجلسرين استجابة للتحفيز الكيميائي. يكشف زرع الخلايا الشحمية المزروعة ب SWAT عن رواسب دهنية مرئية بوضوح ومستعادة بسهولة بعد 10 أيام من الزرع والتي تلطخ علامات الخلايا الشحمية البشرية ولكن ليس الفئران.

بمجرد إتقانها ، يمكن إكمال هذه التقنية في حوالي خمس ساعات إذا تم إجراؤها بشكل صحيح. من المهم أن تتذكر معالجة الأنسجة الأولية بسرعة لتقليل موت الخلايا. باتباع هذا الإجراء ، يمكن إجراء طرق أخرى مثل تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي في الوقت الفعلي أو التلوين المناعي أو المقايسات الوظيفية للإجابة على أسئلة إضافية حول كيفية استجابة الخلايا الشحمية للأدوية أو السموم المختلفة.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية أداء ثقافة SWAT كمنصة مستقرة وموثوقة لأبحاثك في الدهون. لا تنس أن العمل مع الأنسجة البشرية الأولية يمكن أن يكون خطيرا ، وأنه يجب دائما اتخاذ الاحتياطات مثل ارتداء معدات الوقاية الشخصية المناسبة والتعامل مع الأنسجة الموجودة أسفل خزانات السلامة الحيوية أثناء تنفيذ هذا الإجراء.