الكشف عن "البروتين التعريب سوبسيلولار الأخضر Fluorescence علامات البروتين" و 4 ', 6-دياميدينو-2-فينيليندولي تلطيخ في ايليجانس كاينورهابديتيس

يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال C.elegans ، مثل بيولوجيا الخلية. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها سريعة وفعالة للحصول على إشارات التلوين النووي ، GFP ، وتغييرات التوطين الخلوي في وقت واحد. للبدء ، قم بإنشاء مصفوفة خارج كروموسومات تتماشى مع بنية انتقالية للجينات المستهدفة.

بدلا من ذلك ، احصل على هذه الخطوط من مركز Caenorhabditis الوراثي ، وهو مورد عام لأبحاث C.elegans. أو من مختبر أبحاث منشور سابقا. بعد تعريض الديدان لإشعاع جاما لدمج الخطوط خارج الكروموسومات في الجينوم ، حدد الخطوط المعبر عنها بثبات بحيث يعبر كل عن بروتين علامة مثل GFP أو الأسطوانة.

لإزالة الطفرات المتولدة أثناء الإشعاع ، تجاوز الخطوط مرتين على الأقل. استخدم الخط المعدل وراثيا الناتج للكشف عن تغيرات نمط تعبير البروتين تحت الضغط. بعد ذلك ، بعد تحضير ألواح دودة NGM وفقا لبروتوكول النص ، قم باستنساخ OP50 وزرع البكتيريا في مرق LB السائل طوال الليل.

قم بزرع ألواح NGM بثقافة OP50 السائلة واحتضان الألواح في حاضنة 37 درجة مئوية طوال الليل لزراعة عشب البكتيريا كمصدر غذائي للديدان. قم بتبريد الأطباق في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة على الأقل قبل الاستخدام. قم بزراعة الخط المعدل وراثيا عند 20 درجة مئوية دون جوعة ، لمدة جيلين على الأقل قبل اختبار الإجهاد الحراري.

اختر ثمانية إلى عشرة شباب بالغين في صفيحة دودة جديدة. ثم دعهم يضعون البيض لمدة ثلاث إلى خمس ساعات ، وأخرجوا جميع البالغين من الأطباق. لمزامنة الديدان ، دع البيض يفقس وينمو اليرقات لمدة 48 ساعة تقريبا إلى اليرقات الرابعة ، أو المرحلة L4.

يمكن التعرف على ذلك من خلال الفرج ، وهو هيكل نصف قمر. ثم قم بالضغط الحراري على الديدان عن طريق احتضان الصفائح مع يرقات L4 عند 35 درجة مئوية لمدة ساعتين إلى خمس ساعات. قم بتضمين مقياس حرارة في حاضنة لقياس درجة الحرارة بدقة.

ماصة 10 ميكرولتر من M9 على وسط شريحة زجاجية. ثم اختر الديدان المصابة بالصدمة الحرارية وانقلها إلى قطرة العازلة. بدلا من ذلك ، استخدم M9 لغسل الديدان من اللوحة.

ثم قم بالطرد المركزي للعينة عند 1000 مرة من الجاذبية في درجة حرارة الغرفة لمدة دقيقة واحدة. تخلص من المادة الطافية ، ثم أضف الديدان إلى الشريحة الزجاجية. تحت مجهر تشريح ، استخدم منديلا ناعما لتصريف أي سائل زائد.

بعد ذلك ، بينما لا تزال تحت المجهر ، أضف 10 ميكرولترات من الكحول بنسبة 95٪ على الديدان واستمر في مراقبتها. مباشرة بعد أن يجف الإيثانول ، كرر إضافة الإيثانول مرتين أخريين. إنه أمر بالغ الأهمية لعملية تبخر الإيثانول من تحت مجهر التشريح.

بمجرد خروج الإيثانول من ، انتقل على الفور إلى الخطوة التالية. أضف 10 ميكرولتر من DAPI إلى الديدان. ضع على الفور زلة غطاء وأغلق الشريحة بجل طلاء الأظافر الشفاف.

بعد السماح لطلاء الأظافر بتثبيته لمدة 10 دقائق تقريبا ، شاهد تحت المجهر الفلوري. لإصلاح بالأسيتون ، استخدم M9 لغسل اللوحة المصابة بالصدمة الحرارية والطرد المركزي للعينة عند 1000 مرة من الجاذبية في درجة حرارة الغرفة لمدة دقيقة واحدة. تخلص من المادة الطافية واستخدم ملليلترا واحدا من الماء المقطر لغسل الحبيبات.

بعد إزالة المادة الطافية ، أضف 400 ميكرولتر من الأسيتون بنسبة 30٪ واحتضن العينة لمدة 15 دقيقة. ثم قم بالطرد المركزي للأنبوب عند 1000 مرة من الجاذبية في درجة حرارة الغرفة لمدة دقيقة واحدة. بعد التخلص من المادة الطافية ، استخدم 500 ميكرولتر من الماء المقطر لغسل مرتين.

أضف 200 ميكرولتر من DAPI إلى الحبيبات ، أو أربعة أضعاف كمية الحجم الكلي للديدان في الأنبوب ، واحتضن العينة لمدة 15 دقيقة. الطرد المركزي العينة والتخلص من المادة الطافية. ثم استخدم 500 ميكرولتر من الماء المقطر لغسل الحبيبات مرتين قبل التركيب والتصوير كما كان من قبل.

لإجراء التصوير ، قم بتشغيل مصدر ضوء الأشعة فوق البنفسجية والمجهر الفلوري. ثم قم بتشغيل الكمبيوتر المتصل بالمجهر. قم بتحميل الشريحة على المجهر الفلوري.

استخدم عدسة موضوعية 10X لتحديد موقع الديدان. ثم قم بزيادة قوة التكبير إلى 400X وركز على العينة. بعد ذلك ، افتح البرنامج المرفق مع المجهر.

انقر فوق اكتساب ، ثم انقر فوق الكاميرا ، وحدد الكاميرا المتصلة بالمجهر. تحت نفس الاستحواذ ، انقر فوق الاستحواذ متعدد الأبعاد. يؤدي هذا إلى فتح نافذة تنقل جديدة للاكتساب متعدد الأبعاد.

انقر فوق الزر متعدد القنوات وستظهر جميع القنوات المتاحة. اختر اللون الأزرق والأخضر و DIC لمراقبة العينة. في نافذة التنقل في الاكتساب متعدد الأبعاد، اترك قنوات DAPI الزرقاء وGFP الخضراء وDIC الرمادية قيد التشغيل، وانقر بزر الماوس الأيمن فوق القنوات الأخرى، مثل الرودامين الأحمر والبرايتفيلد الأبيض، لإغلاقها.

لقياس وقت التعرض لكل قناة ، انقر بزر الماوس الأيسر فوق قناة DAPI الزرقاء لتحديدها وانقر فوق قياس "لالتقاط صورة حية مع وقت تعرض تلقائي. على الجانب الأيسر من نافذة الصورة الحية، اضبط وقت التعريض الضوئي يدويا إذا رغبت في ذلك، ثم انقر فوق موافق. قم بإعداد أوقات التعرض لقنوات GFP و DIC بطريقة مماثلة. في نافذة التنقل متعددة الأبعاد للاكتساب ، انقر فوق ابدأ "لجمع ثلاث صور تلقائيا ضمن القنوات الثلاث المختلفة ، بالترتيب ، مع أوقات التعرض المحددة.

لحفظ الملف ، في القائمة الرئيسية ، انقر فوق ملف ، حفظ باسم ، أدخل اسم الملف والمجلد. احفظ الملف كتنسيق الملف الافتراضي للاحتفاظ بمعلومات التصوير التفصيلية للرجوع إليها في المستقبل. لتصدير الملف بتنسيقات أخرى، ضمن ملف، انقر فوق تصدير.

قم بتعيين اسم الملف والمجلد. تحقق من إنشاء مجلد مشروع"لتنظيم البيانات بشكل أفضل. بعد اختيار نوع الملف المطلوب من القائمة المنسدلة ، انقر فوق ابدأ" للتصدير.

هناك نوعان من متماثلات بروتين قناة الكلوريد داخل الخلايا في C.elegans ، exl-1 و exc-4. أظهرت دراسة حديثة أن exl-1 ينظم إدارة الإجهاد الحيواني. هنا ، تم دمج بنية exl-1 GFP الانتقالية في جينوم حيواني ، وتم إنشاء خطوط معدلة وراثيا ، والتي تعبر بثبات عن الفلورسنت الأخضر exl-1.

تحت الإجهاد الحراري ، يتراكم exl-1 GFP في النواة في منطقة الأمعاء حيث تتداخل إشارة GFP القوية مع النواة. لتأكيد التوطين الخلوي ل exl-1 ، تم إجراء تلطيخ DAPI في كل من الثابتة بالإيثانول والأسيتون. تظهر كلتا الطريقتين نوى واضحة في جسم وتؤكد إشارات GFP و DAPI المتداخلة أن exl-1 GFP تراكمت بالفعل في النوى في منطقة الأمعاء.

بمجرد إتقانها ، يمكن القيام بهذه التقنية في ساعة واحدة إذا تم إجراؤها بشكل صحيح. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إجراء تثبيت سريع للحفاظ على إشارة GFP والانتقال النووي للبروتين تحت الضغط في C.elegans.