تصوير فيتك-ديكستران كمراسل للرقابة الخاضعة للتنظيم

يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في أبحاث إفراز الخلايا المنظم ، من خلال السماح للباحثين بالتمييز بين الأنماط المختلفة لإفراز الخلايا في الخلية الحية. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها بسيطة وتتطلب الحد الأدنى من الاضطراب في الخلايا. على الرغم من أن هذه الطريقة يمكن أن توفر نظرة ثاقبة لإفراز الخلايا البدينة ، إلا أنه يمكن تطبيقها أيضا على الخلايا الإفرازية الأخرى مثل العدلات والحمضات.

للبدء ، قم بإعداد حل مخزون من 20x المخزن المؤقت ل Tyrode وفقا لبروتوكول النص. بعد ذلك ، امزج ثلاثة ملليغرامات من مسحوق FITC-dextaren مع ثلاثة ملليلتر من وسائط الاستزراع. قم بتصفية FITC-dextan المذاب باستخدام وحدة تصفية حقنة أسيتات السليلوز.

ثم أضف IgE للفأر إلى تركيز ميكروغرام واحد لكل ملليلتر. قبل يوم واحد من التصوير ، استنشق الوسائط من طبق الثقافة واستبدلها بملليلترين من محلول Trypsin EDTA B. ثم احتضن الطبق لمدة خمس إلى 10 دقائق. بمجرد انفصال الخلايا ، أضف ملليلترين من وسائط الثقافة إلى الطبق لتحييد التربسين.

بعد ذلك ، استخدم مقياس الدم لحساب خلايا RBL. اضبط حجم التعليق باستخدام وسائط الثقافة لتحقيق تركيز 750 ، 000 خلية لكل مليلتر. بعد ذلك ، أضف 10 ميكرولترات من تعليق الخلية إلى غطاء زجاجي مع وسائط استزراع جديدة مكملة ب FITC-dextran ، وقم بتنمية خلايا RBL بين عشية وضحاها.

أولا ، قم بإعداد حل المخزن المؤقت النهائي ل Tyrode وفقا لبروتوكول النص. بعد ذلك ، قم بإعداد كاشف إفرازات 20x في المخزن المؤقت الطازج. قم بإذابة مسحوق كلوريد الأمونيوم في عازلة Tyrode لإنشاء محلول كلوريد الأمونيوم 400 مللي مولار.

بعد ذلك ، قم بشفط الوسائط من الغطاء الزجاجي المزود بالحجرة واستبدلها ب 300 ميكرولتر من عازلة Tyrode الدافئة مسبقا. بعد تكرار عملية الغسيل مرتين ، قم بتجديد الغرفة ب 300 ميكرولتر من عازلة Tyrode. بعد ذلك ، ضع الغطاء الزجاجي في غرفة الحاضنة في المجهر وتأكد من استقرار الغرفة.

قم بتشغيل مصدر ضوء الفلورسنت وحدد مرشح التألق المناسب. بمجرد أن تصبح منطقة الاهتمام في بؤرة التركيز ، في منتصف مجال الرؤية ، قم بإيقاف تشغيل مصدر الضوء. بعد ذلك ، قم بتشغيل الليزر 488 نانومتر مع الانبعاثات المجمعة حوالي 500 إلى 550 نانومتر.

بعد ذلك ، قم بمعايرة الفاصل الزمني بين عمليات الحصول على الصور. اضبط اتجاه المسح الضوئي على ثنائي الاتجاه ، ولا تسمح بالمتوسط ، وافتح الثقب ، واضبط الدقة على 512 × 512. بعد ذلك ، قم بتصوير الخلايا للمدة المناسبة لنوع الخلية أو الإفراز المحدد.

ثم أضف 16 ميكرولترا من محلول الإفراز إلى الغرفة واستمر في التصوير. أخيرا ، لتأكيد وجود وتوطين FITC-dextern في الحبيبات الإفرازية ، أضف برفق 16 ميكرولترا من محلول كلوريد الأمونيوم إلى الغرفة. في هذا البروتوكول ، تم استخدام FITC-dextran كمراسل لتصوير الخلايا الحية لإفراز الخلايا المنظمة.

يسمح إطلاق التصوير FITC-dexterrn بالتقاط الطبيعة المتسلسلة لإفراز الخلايا المركب. بعد إضافة كلوريد الأمونيوم إلى الوسائط ، يصبح FITC-dextern مرئيا ويتم توطينه بشكل مشترك مع الببتيد العصبي Y الذي يحمل علامة mRFP ، كمراسل حبيبي إفرازي في خلايا RBL. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم تقليل سمية الخلايا أثناء التصوير عن طريق تقليل تعرض الخلايا لليزر.

يمكن تحقيق ذلك من خلال استخدام طاقة الليزر المنخفضة ووقت الاستحواذ القصير. نظرا لأن الأحداث الخارجية المركبة تعيش لفترة أطول مقارنة بالأحداث الخارجية المنظمة الأخرى ، يمكننا التقاط إفراز الخلايا المركب بشكل قاطع عن طريق تحديد فاصل زمني طويل بين عمليات الاستحواذ.