بكر الرقمية للتحديد الكمي لتعميم MicroRNAs في احتشاء عضلة القلب الحاد وأمراض القلب والأوعية الدموية

قد تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال التشخيص ، مثل ما إذا كانت الحمض النووي الريبي الدقيق مؤشرات حيوية صالحة في أمراض القلب والأوعية الدموية. بالمقارنة مع تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي في الوقت الفعلي ، يظهر تفاعل البوليميراز المتسلسل الرقمي صفات تقنية فائقة لقياس microRNAs في الدورة الدموية. نظرا لأن العينة مقسمة إلى حوالي 20،000 قطرة ، فلا يلزم إجراء قياسات مكررة ، ولا حاجة إلى منحنى قياسي للقياس الكمي.

على الرغم من أن هذه الطريقة قد توفر نظرة ثاقبة للقياس الكمي للحمض النووي الريبي الصغير في مرضى القلب والأوعية الدموية ، إلا أنه يمكن تطبيقها أيضا على مرضى وأمراض أخرى ، حيث أظهرت الحمض النووي الريبي الصغير الأخرى نتائج واعدة كمؤشرات حيوية في تطور السرطان ، ويمكن تطبيقها أيضا على مرضى الأورام. بشكل عام ، سيكافح الأفراد الجدد في هذه الطريقة لأن القطرات المتولدة هشة وتحتاج إلى التعامل معها بحذر. بعد عزل الحمض النووي الريبي من عينات المصل ، استمر في النسخ العكسي للحصول على حمض نووي تكميلي أكثر استقرارا ل dPCR.

للبدء ، قم بإذابة مجموعة النسخ العكسي على الجليد. ثم قم بتدوير الإنزيمات والبادئات لأسفل. بعد ذلك ، قم بإعداد المزيج الرئيسي كما هو موضح في بروتوكول النص.

امزج 10 ميكرولترات من المزيج الرئيسي مع خمسة ميكرولترات من الحمض النووي الريبي المستخرج في كل بئر من صفيحة 96 بئرا. ثم قم بالطرد المركزي للوحة عند 2 ، 000 × جم عند أربع درجات مئوية لمدة دقيقتين. تابع النسخ العكسي كما هو مفصل في بروتوكول النص.

أولا ، قم بإذابة مزيج dPCR التجاري ، وبادئات cDNA و PCR على الجليد وأجهزة الطرد المركزي مباشرة قبل الاستخدام. ثم قم بإعداد المزيج الرئيسي كما هو موضح في بروتوكول النص. أضف 1.33 ميكرولتر من منتج النسخ العكسي إلى 18.67 ميكرولتر من المزيج الرئيسي وجهاز الطرد المركزي لفترة وجيزة.

باستخدام ماصة ، انقل 20 ميكرولترا من العينة إلى كل بئر من الصف المتوسط لكاسيت ثمانية آبار. ثم قم بإخراج 70 ميكرولترا من زيت توليد القطرات في آبار النفط في الكاسيت. بعد ذلك ، ضع حشية أعلى الكاسيت وضعها في مولد القطرات.

أغلق مولد القطرات وانتظر حتى تصبح أضواء المؤشر الثلاثة خضراء ثابتة. باستخدام ماصة ، انقل بعناية 40 ميكرولترا من العينة المتكونة من القطرات إلى آبار منفصلة من صفيحة 96 بئرا. ثم أغلق اللوحة بورق dPCR عند 180 درجة مئوية لمدة أربع ثوان.

ضع لوحة PCR المختومة في الدراجة واتبع تعليمات ركوب الدراجات الموضحة في بروتوكول النص. قم بإزالة اللوحة من جهاز التدوير الحراري وانقلها إلى قاعدة حامل اللوحة. ثم ضع الجزء العلوي من حامل اللوحة على لوحة PCR.

أخيرا ، ابدأ برنامج dPCR التجاري. في هذا البروتوكول ، تم استخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل الرقمي لتحديد microRNAs في مصل المرضى الذين يعانون من أمراض القلب والأوعية الدموية. تم أخذ عينات من 16 مريضا قبل وثماني ساعات بعد التدخل عن طريق الجلد.

أظهر المرضى الذين يعانون من احتشاء عضلة القلب المرتفع ST زيادة كبيرة في مستويات miR-499 مقارنة بالمرضى الذين يعانون من مرض الشريان التاجي المستقر. بمجرد إتقانها ، يمكن إجراء هذه التقنية في حوالي ساعة لتكوين قطرات من 96 عينة إذا تم إجراؤها بشكل صحيح. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تضع في اعتبارك التعامل مع القطرات بعناية.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إجراء تفاعل البوليميراز المتسلسل الرقمي بشكل صحيح ، عن طريق تكوين القطرات الصحيحة ، وركوب الدراجات ، والقراءة ، والتحليل.