بكر الرقمية للتحديد الكمي لتعميم MicroRNAs في احتشاء عضلة القلب الحاد وأمراض القلب والأوعية الدموية
يوليو 3, 2018
وقد أظهرت ميكرورناس تعميم الوعد المؤشرات الحيوية لأمراض القلب والأوعية الدموية وقال عضلة القلب الحاد. في هذه الدراسة، يمكننا وصف بروتوكول لاستخراج ميرنا والنسخ العكسي، وبكر الرقمية للتحديد الكمي المطلق ميرناس في مصل المرضى الذين يعانون من أمراض القلب والأوعية الدموية.
قد تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال التشخيص ، مثل ما إذا كانت الحمض النووي الريبي الدقيق مؤشرات حيوية صالحة في أمراض القلب والأوعية الدموية. بالمقارنة مع تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي في الوقت الفعلي ، يظهر تفاعل البوليميراز المتسلسل الرقمي صفات تقنية فائقة لقياس microRNAs في الدورة الدموية. نظرا لأن العينة مقسمة إلى حوالي 20،000 قطرة ، فلا يلزم إجراء قياسات مكررة ، ولا حاجة إلى منحنى قياسي للقياس الكمي.
على الرغم من أن هذه الطريقة قد توفر نظرة ثاقبة للقياس الكمي للحمض النووي الريبي الصغير في مرضى القلب والأوعية الدموية ، إلا أنه يمكن تطبيقها أيضا على مرضى وأمراض أخرى ، حيث أظهرت الحمض النووي الريبي الصغير الأخرى نتائج واعدة كمؤشرات حيوية في تطور السرطان ، ويمكن تطبيقها أيضا على مرضى الأورام. بشكل عام ، سيكافح الأفراد الجدد في هذه الطريقة لأن القطرات المتولدة هشة وتحتاج إلى التعامل معها بحذر. بعد عزل الحمض النووي الريبي من عينات المصل ، استمر في النسخ العكسي للحصول على حمض نووي تكميلي أكثر استقرارا ل dPCR.
للبدء ، قم بإذابة مجموعة النسخ العكسي على الجليد. ثم قم بتدوير الإنزيمات والبادئات لأسفل. بعد ذلك ، قم بإعداد المزيج الرئيسي كما هو موضح في بروتوكول النص.
امزج 10 ميكرولترات من المزيج الرئيسي مع خمسة ميكرولترات من الحمض النووي الريبي المستخرج في كل بئر من صفيحة 96 بئرا. ثم قم بالطرد المركزي للوحة عند 2 ، 000 × جم عند أربع درجات مئوية لمدة دقيقتين. تابع النسخ العكسي كما هو مفصل في بروتوكول النص.
أولا ، قم بإذابة مزيج dPCR التجاري ، وبادئات cDNA و PCR على الجليد وأجهزة الطرد المركزي مباشرة قبل الاستخدام. ثم قم بإعداد المزيج الرئيسي كما هو موضح في بروتوكول النص. أضف 1.33 ميكرولتر من منتج النسخ العكسي إلى 18.67 ميكرولتر من المزيج الرئيسي وجهاز الطرد المركزي لفترة وجيزة.
باستخدام ماصة ، انقل 20 ميكرولترا من العينة إلى كل بئر من الصف المتوسط لكاسيت ثمانية آبار. ثم قم بإخراج 70 ميكرولترا من زيت توليد القطرات في آبار النفط في الكاسيت. بعد ذلك ، ضع حشية أعلى الكاسيت وضعها في مولد القطرات.
أغلق مولد القطرات وانتظر حتى تصبح أضواء المؤشر الثلاثة خضراء ثابتة. باستخدام ماصة ، انقل بعناية 40 ميكرولترا من العينة المتكونة من القطرات إلى آبار منفصلة من صفيحة 96 بئرا. ثم أغلق اللوحة بورق dPCR عند 180 درجة مئوية لمدة أربع ثوان.
ضع لوحة PCR المختومة في الدراجة واتبع تعليمات ركوب الدراجات الموضحة في بروتوكول النص. قم بإزالة اللوحة من جهاز التدوير الحراري وانقلها إلى قاعدة حامل اللوحة. ثم ضع الجزء العلوي من حامل اللوحة على لوحة PCR.
أخيرا ، ابدأ برنامج dPCR التجاري. في هذا البروتوكول ، تم استخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل الرقمي لتحديد microRNAs في مصل المرضى الذين يعانون من أمراض القلب والأوعية الدموية. تم أخذ عينات من 16 مريضا قبل وثماني ساعات بعد التدخل عن طريق الجلد.
أظهر المرضى الذين يعانون من احتشاء عضلة القلب المرتفع ST زيادة كبيرة في مستويات miR-499 مقارنة بالمرضى الذين يعانون من مرض الشريان التاجي المستقر. بمجرد إتقانها ، يمكن إجراء هذه التقنية في حوالي ساعة لتكوين قطرات من 96 عينة إذا تم إجراؤها بشكل صحيح. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تضع في اعتبارك التعامل مع القطرات بعناية.
بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إجراء تفاعل البوليميراز المتسلسل الرقمي بشكل صحيح ، عن طريق تكوين القطرات الصحيحة ، وركوب الدراجات ، والقراءة ، والتحليل.
اعرض النص الكامل واحصل على الوصول إلى آلاف الفيديوهات العلمية
نظرة عامة
تقدم هذه الدراسة بروتوكولاً لاستخلاص وقياس كمية الـ microRNAs المتداولة كمؤشرات حيوية محتملة لأمراض القلب والأوعية الدموية. ومن خلال استخدام تقنية الـ digital PCR، تهدف هذه الطريقة إلى تعزيز دقة قياس الـ miRNA في عينات المصل المأخوذة من المرضى الذين يعانون من حالات قلبية وعائية.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلوم
- أمراض القلب والأوعية الدموية
- المؤشرات الحيوية
- تحليل MicroRNA
خلفية علمية
- تُعد جزيئات microRNAs أنواعاً من الحمض النووي الريبي غير المشفر والصغير التي تساهم في تنظيم التعبير الجيني.
- وقد برزت هذه الجزيئات كعلامات حيوية محتملة لمجموعة متنوعة من الأمراض، بما في ذلك أمراض القلب والأوعية الدموية.
- ويوفر تقنية الـ Digital PCR مزايا تتفوق على الطرق التقليدية في تقدير كمية microRNAs.
- إن فهم ملفات تعبير miRNA يمكن أن يساعد في تشخيص أمراض القلب والأوعية الدموية وإدارتها.
الغرض من الدراسة
- التحقق من صحة استخدام الـ microRNAs كعلامات بيولوجية لأمراض القلب والأوعية الدموية.
- إثبات فعالية تقنية الـ digital PCR في قياس كمية الـ miRNAs المنتشرة.
- توفير بروتوكول موثوق للباحثين في هذا المجال.
الطرق المستخدمة
- استخلاص miRNAs من عينات المصل.
- النسخ العكسي لتخليق الحمض النووي المكمل.
- استخدام PCR الرقمي للتقدير الكمي المطلق لـ miRNAs.
- مقارنة PCR الرقمي مع PCR الكمي في الوقت الحقيقي.
النتائج الرئيسية
- أظهر تفاعل البوليميراز المتسلسل الرقمي (Digital PCR) دقة فائقة في التقدير الكمي لـ miRNA.
- تسمح هذه الطريقة بتحليل الآلاف من القطرات دون الحاجة إلى منحنيات قياسية.
- تمتد إمكانية تطبيق هذه الطريقة إلى ما هو أبعد من أمراض القلب والأوعية الدموية لتشمل حالات أخرى مثل السرطان.
- لوحظ وجود تحديات في التعامل مع القطرات الهشة بالنسبة للمستخدمين الجدد لهذه التقنية.
الاستنتاجات
- تدعم الدراسة استخدام جزيئات microRNAs المتداولة كمؤشرات حيوية لأمراض القلب والأوعية الدموية.
- تعد تقنية PCR الرقمية أداة واعدة للتقدير الكمي الدقيق لـ miRNA.
- يمكن أن تؤدي الأبحاث المستقبلية إلى توسيع نطاق تطبيق هذه الطريقة ليشمل أمراضاً أخرى.
الأسئلة الشائعة
الأهمية الصناعية التنفيذية
يوفر التحديد الكمي لجزيئات microRNAs المنتشرة باستخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل الرقمي (digital PCR) نهجاً عالي الحساسية وقابلاً للتكرار للتحقق من صحة المؤشرات الحيوية في أبحاث أمراض القلب والأوعية الدموية. وتدعم هذه الطريقة التحقق من الأهداف وتطوير المقايسات من خلال تمكين التحديد الكمي المطلق دون الحاجة إلى منحنيات قياسية، مما يقلل من التباين في الدراسات متعددة المراكز. كما تعزز هذه التقنية الثقة التنبؤية في مراحل الاكتشاف المبكر من خلال ربط تعبير miRNA بالمرض، مما يساهم في اتخاذ قرارات المضي قدماً أو التوقف عند اختبار الفرضيات العلاجية.
التطبيقات الاستراتيجية في البحث والتطوير بالمجال الصيدلاني الحيوي
الاكتشاف المبكر والتحقق من الهدف
- القيمة العلمية: تمكّن من استقصاء الفرضيات العلاجية من خلال قياس كمية الـ miRNAs النوعية للمرض مثل miR-499 في حالات احتشاء عضلة القلب الحاد (AMI).
- القيمة التشغيلية: توفر أعداد نسخ مطلقة من الـ miRNA دون الحاجة إلى منحنيات قياسية، مما يحسّن من إمكانية تكرار النتائج عبر المواقع المختلفة.
- القيمة التنبؤية: تدعم فرز محفظة المشاريع الموجهة بالمؤشرات الحيوية من خلال ربط مستويات miRNA بالاعتلالات القلبية الوعائية.
الفحص وتطوير المقايسة
- القيمة العلمية: توليد أنظمة بيولوجية موثقة (cDNA من RNA المصل) لسير عمل الفرز اللاحق.
- القيمة التشغيلية: توفير مخرجات ذات خطية عالية وتباين منخفض مناسبة لتقييس المقايسة.
- القابلية للتوسع: تتيح معالجة 96 عينة في غضون ساعة واحدة تقريباً بعد تحضير المزيج الرئيسي، مما يدعم الفرز متوسط الإنتاجية.
الأبحاث الترجمية وما قبل السريرية
- الاستمرارية الترجمية: تربط بين قياس كمية miRNA في مرحلة الاكتشاف وبين التحقق قبل السريري من خلال المؤشرات الحيوية المصلية ذات الصلة بالمرض.
- تقليل المخاطر الميكانيكية: تقلل من الغموض في التحقق من الهدف عن طريق ربط تعبير miRNA بالإصابة القلبية الوعائية.
- مواءمة المؤشرات الحيوية: تدعم تطوير المؤشرات الحيوية الترجمية من خلال قياس كمية miRNAs ذات النوعية العالية للأنسجة والأمراض.
تكامل مسار العمل وسير العمل
تندرج هذه الطريقة ضمن سلسلة عمليات الاكتشاف، بدءاً من اختبار الفرضيات وصولاً إلى تحديد المركبات الرائدة، حيث توفر بيانات كمية لـ miRNA تعزز الثقة في الأهداف المحددة ومدى جاهزية المقايسة.
- بيولوجيا الاكتشاف: تدعم اختبار الفرضيات عن طريق قياس كمية إطلاق miRNA من الخلايا القلبية الوعائية إلى الدورة الدموية.
- المسح: تُنتج مخرجات قياسية جاهزة للمقايسة ذات حساسية عالية لتقييم المؤشرات الحيوية المرشحة.
- التحليلات: تتيح المقارنة المباشرة لمستويات miRNA عبر ظروف مختلفة باستخدام القياس الكمي المطلق دون الحاجة إلى منحنيات قياسية.
- الأبحاث الانتقالية: تعزز استمرارية المؤشرات الحيوية من خلال ربط ملفات miRNA الدورية بالاعتلالات القلبية الوعائية.
- إعادة الاستخدام المؤسسي: تؤسس منصة قياس كمي قابلة لإعادة الاستخدام وتطبيقها عبر مؤشرات أمراض القلب والأوعية الدموية والأورام.
التأثير التشغيلي والمؤسسي
- القيمة العلمية: تزيد من الثقة التنبؤية في صلاحية المؤشر الحيوي من خلال قياس كمي لـ miRNA يتميز بتنوع منخفض وحساسية عالية.
- القيمة التشغيلية: تضمن قابلية التكرار والتوحيد القياسي عبر التقسيم القائم على القطيرات، مما يلغي القياسات المكررة.
- القيمة الاستراتيجية: تحسن قرارات المضي قدماً أو التوقف عن طريق تقليل الغموض الميكانيكي في العلاقات بين المؤشر الحيوي والهدف.
- التأثير على محفظة المشاريع: تمكّن من التقدم المعدل حسب المخاطر من خلال بيانات miRNA الكمية المرتبطة بالباثولوجيا.
اعتبارات التنفيذ
- يتطلب خبرة في عزل RNA، والنسخ العكسي، والتعامل مع القطيرات لمنع فقدان العينات.
- يستلزم توفر معدات توليد القطيرات، وأجهزة PCR الدورية، وبرمجيات dPCR لضمان التكميم الدقيق.
- يتطلب توحيد معايير بروتوكولات تكوين القطيرات وإغلاقها بين الفرق لضمان تكرارية النتائج.
- يتضمن اعتبارات التكييف عند التطبيق على أنواع مختلفة من العينات بخلاف المصل، مثل البلازما أو محللات الأنسجة.
- يشمل قيوداً عملية مثل الحساسية العالية عند التعامل مع القطيرات، مما قد يؤثر على الإنتاجية بالنسبة للمستخدمين غير المتمرسين.
