استخدام الماوس سبلينوسيتيس لتقييم تأثير نمط الجزيئية المرتبطة بالعوامل الممرضة في التعبير الجيني على مدار الساعة

يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجالات علم المناعة وعلم الأحياء الزمني ، مثل كيفية تغيير المكونات الميكروبية للساعة الجزيئية. تتمثل المزايا الرئيسية لهذه التقنية في سهولة أدائها ، ويتم تقييم تأثيرات المكونات الميكروبية المختلفة على الساعة الجزيئية ، وهي قابلة للتكرار بدرجة كبيرة. لبدء البروتوكول ، قم بإعداد وسط الاستزراع عن طريق إضافة مصل الأبقار الجنيني إلى RPMI 1640 إلى التركيز النهائي بنسبة 10٪ قم بإعداد 10 ملليلتر من وسط التحدي لكل من PAMPS ليتم اختباره في أنابيب سعة 50 مليلتر عن طريق إضافة وسط استزراع PAMP المدرج.

رش جذع الماوس المعد مسبقا بنسبة 70٪ من الإيثانول وامسحه بمنشفة ورقية. ضع الماوس على ظهره ، مائلا قليلا على جانبه الأيمن. بعد ذلك ، قم بقص الفراء باستخدام مقص تشريح على طول الجانب الأيسر من الماوس ، في منتصف الطريق تقريبا بين الساقين الأمامية والخلفية.

باستخدام الملقط ، أمسك الصفاق وقم بعمل شق بعناية دون الإضرار بالطحال. قم بإزالة الطحال بالملقط وضعه في أنبوب معقم سعة 50 مليلتر يحتوي على ما يقرب من 10 مل من وسائط الاستزراع على الجليد. ثم انقل الطحال مع ملليلترين من وسط الثقافة إلى طبق بتري صغير معقم.

بتجانس الطحال عن طريق طحنه بين الجزء المتجمد من شريحتين بلوريتين معقمين. بمجرد تجانسها تماما ، قم بتقطيع الماصة إلى ملليلترين من وسط الاستزراع الذي يحتوي على خلايا الطحال من خلال مصفاة خلية نايلون 40 ميكرون في أنبوب سعة 50 ملليلترا. أضف ثمانية ملليلتر من وسط الاستزراع البارد إلى كل أنبوب من الأنابيب سعة 50 مليلتر التي تحتوي على خلايا الطحال ، ليصبح الحجم الإجمالي 10 ملليلتر لكل أنبوب.

حدد عدد الخلايا لكل مليلتر باستخدام مقياس كثافة الدم. أضف ما يقرب من 10 في 10 إلى الخلايا السادسة لكل بئر إلى ألواح الثقافة المكونة من ستة آبار. بعد إضافة الخلايا ، أضف ثلاثة ملليلتر من وسط الثقافة أو ثلاثة ملليلتر من وسط التحدي إلى الخلايا.

ثم احتضان الصفائح عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة ثلاث ساعات. اكشط الخلايا من قاع البئر باستخدام طرف ماصة سعة 1,000 ميكرولتر متصل بماصة دقيقة P1000. باستخدام نفس طرف الماصة ، انقل الوسط الذي يحتوي على الخلايا إلى أنبوب سعة 15 ملليلترا.

حبيبات الخلايا في 167 مرات جم لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. قم بإزالة المادة الطافية واغسل حبيبات الخلية بخمسة ملليلتر من PBS. بعد تكوير الخلايا مرة ثانية عند 167 مرة جم لمدة خمس دقائق ، قم بإزالة المادة الطافية وأضف 600 ميكرولتر من محلول التحلل إلى حبيبات الخلية.

اعزل الحمض النووي الريبي من خلايا الطحال باستخدام مجموعة استخراج الحمض النووي الريبي وفقا لتعليمات الشركة المصنعة وقم بإجراء عملية هضم الحمض النووي الاختيارية على العمود. قم بتجميع (كدنا) لكل عينة باستخدام مجموعة النسخ العكسي وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. استخدم 10 ميكرولتر من الحمض النووي الريبي لكل عينة في حجم تفاعل إجمالي يبلغ 20 ميكرولتر.

اسحب mRNA من عدد قليل من عينات التحكم في أنبوب 0.5 مليلتر لإعداد (كدنا) لاستخدامه في المنحنى القياسي عند إجراء تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي. أضف 10 ميكرولترات من مزيج النسخ العكسي الرئيسي 2X. عند الانتهاء من النسخ العكسي ، أضف 10 ميكرولتر من الماء إلى أنبوب التفاعل ، والذي يعمل كتركيز البداية في سلسلة التخفيف للمنحنى القياسي.

قم بإجراء سلسلة تخفيف من عشرة أضعاف عن طريق إضافة 45 ميكرولترا من الماء إلى أربعة أنابيب سعة 0.5 مليلتر مخصصة 10 أس سالب واحد ، و 10 إلى سالب اثنين ، و 10 إلى سالب ثلاثة ، و 10 إلى سالب أربعة. أضف خمسة ميكرولترات من تركيز البداية واحدا في الأنبوب الثاني ، 10 إلى ناقص واحد ، باستخدام ماصة دقيقة P20. امزج عن طريق سحب العينات لأعلى ولأسفل عدة مرات ثم انقل خمسة ميكرولترات من 10 إلى ناقص أنبوب واحد إلى الأنبوب المخصص 10 إلى الأنبوب ناقص اثنين واخلطها.

انقل خمسة ميكرولترات باستخدام ماصة دقيقة P20 من الأنبوب 10 إلى الأنبوب الناقص اثنين إلى الأنبوب المخصص 10 إلى سالب ثلاثة واخلطه. أخيرا ، انقل خمسة ميكرولترات باستخدام ماصة دقيقة P20 من الأنبوب 10 إلى الأنبوب الناقص ثلاثة إلى الأنبوب المخصص 10 إلى سالب أربعة واخلطها. قم بإعداد التفاعل بحيث يحتوي على 0.5 ميكرولتر من مقايسة المسبار التمهيدي ، وخمسة ميكرولتر من مزيج التعبير الجيني الرئيسي ، وميكرولترين من الماء ، و 2.5 ميكرولتر من الحمض النووي (كدنا).

ماصة عينات الحمض النووي الريبي في لوحة qPCR ذات 96 بئرا. احتضان فحوصات المسبار التمهيدي لجينات الساعة الجزيئية المختلفة وقم بتضمين اختبار للتحكم الداخلي ، وتحميله في جهاز qPCR لتحديد الكمية النسبية لمستويات mRNA. ضمن الإعداد التجريبي ، حدد الكمية والمنحنى القياسي النسبي وكيمياء TaqMan.

بعد ذلك ، قم بتغيير حجم التفاعل إلى 10 ميكرولتر. أدخل المعلومات ذات الصلة في تخطيط اللوحة. تم إجراء qPCR على الحمض النووي الريبي المعزول لتقييم مستويات التعبير النسبية لجينات الساعة الجزيئية ، والساعة ، و Per2 ، و Dbp ، و Rev-erb alpha.

بعد تحدي PAMP ، لم تكن مستويات التعبير على مدار الساعة مختلفة بشكل كبير مقارنة بخلايا التحكم. ارتفعت مستويات التعبير Per2 بشكل ملحوظ في الخلايا التي تواجه تحديا مع LPS و ODN1826 عند مقارنتها بالضوابط التي لا تواجه منازعيا. كان LPS هو PAMP الوحيد الذي غير تعبير ألفا Rev-erb حيث كانت مستويات mRNA أقل بكثير مما كانت عليه في الضوابط التي لا منازع لها.

لوحظت مستويات mRNA أقل بشكل ملحوظ ل Dbp بعد التحدي مع كل من PAMPs عند مقارنتها بالضوابط. باتباع هذا الإجراء ، يمكن استخدام جزيئات أخرى غير PAMPs لتقييم تأثيرها على الساعة الجزيئية في خلايا الطحال.