استخراج الحمض النووي الفائق والتنميط 3dpf الزرد يرقات بالقطع Fin

يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في المجال الطبي الحيوي. مثل استخدام الزرد لتوليد نماذج وراثية للأمراض. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تسمح بالتعرف المبكر على الأنماط الجينية باستخدام طريقة بسيطة عالية الإنتاجية.

على الرغم من أن هذه الطريقة يمكن أن تتيح بحثا مكثفا باستخدام نماذج أسماك الزرد للصرع الوراثي ، إلا أنه يمكن تطبيقها أيضا على نماذج الأمراض الوراثية الأخرى وأي نوع من دراسات الطفرات. بشكل عام ، قد يواجه الأفراد الجدد في هذه الطريقة صعوبات حيث يجب إجراء قطع زعنفة اليرقات بدقة داخل فجوة الصباغ في الذيل. قبل البدء في قص زعنفة يرقات الزرد ، قم بإعداد سطح التشريح.

قم بلصق قطعة من شريط الأوتوكلاف عبر السطح الداخلي لغطاء طبق بتري بطول تسعة سنتيمترات وضع الغطاء تحت مجهر استريو. قم بإعداد طرف ماصة P1000 لاستيعاب يرقة ثلاثية dpf بأقل قدر من الإجهاد، عن طريق قطع طرف طرف الماصة بقطر ملليمترين. ضع يرقات سمك الزرد بعد ثلاثة إلى خمسة أيام من الإخصاب ، أو dpf ، في طبق بتري وقم بتخديرها في 1.5 مللي مولار ثلاثية الكيان في وسط جنين 1x E3.

باستخدام الماصة الدقيقة المعدلة P1000 ، التقط يرقة الزرد وتخديرها وضعها على شريط الأوتوكلاف الموجود على غطاء طبق بتري. قم بإزالة محلول التريكيين الزائد المحيط باليرقة. يجب أن تكون المنطقة جافة قدر الإمكان لتقسيم الزعنفة والتقاطها بنجاح ، ولكنها لا تزال رطبة لضمان البقاء على قيد الحياة.

لتجنب النزيف وضمان بقاء اليرقة أثناء قص الزعانف ، يجب أن يحدث القطع داخل فجوة الصباغ. بعيد إلى حد الدورة الدموية ، كما هو موضح في هذه الصورة. العمل تحت مجهر ستيريو ، استخدم مشرطا صغيرا لتقسيم الزعنفة الذيلية.

أثناء الشق ، استخدم ضغطا ثابتا ولكن لطيفا لأسفل لتجنب إتلاف الحبل الظهري. تصور الزعنفة المقطعة تحت المجهر ، وضع القطعة أعلى طرف شفرة المشرط الدقيقة. ضع المشرط الدقيق الذي يحتوي على الزعنفة على سطح قطعة صغيرة من ورق الترشيح.

بسبب وجود الخلايا الصباغية في الأنسجة المنقولة ، تظهر الزعنفة على شكل بقعة سوداء صغيرة. لضمان استخراج الحمض النووي بنجاح ، من المهم ملاحظة نقطة سوداء تشير إلى وضع الزعنفة على ورق الترشيح قبل متابعة البروتوكول. باستخدام المقص والملاقط ، انقل ورق الترشيح الذي يحتوي على الزعنفة إلى بئر من لوحة PCR سعة 96 بئرا تحتوي على 25 ميكرولترا من محلول هيدروكسيد الصوديوم 50 ملليمول.

بعد ذلك ، قم بإعداد لوحة ثقافة الأنسجة ذات 96 بئر مسطحة القاع ، مع ترقيم الآبار وفقا لملصق لوحة PCR. باستخدام ماصة P1000 المعدلة ، المملوءة ب 200 ميكرولتر من وسط الجنين e3 الطازج ، اجمع يرقة الزرد بعناية باستخدام ضغط لطيف. استغني عن اليرقة في صفيحة 96 بئرا بنفس رقم البئر مثل لوحة PCR.

تأكد من أن ورق الترشيح الذي يحتوي على الزعنفة مغمور جيدا في المحلول. لمنع التلوث المتبادل بين كل قطع ، قم بتنظيف شفرة المشرط الدقيق والملاقط عن طريق الغمس في محلول الإيثانول بنسبة 70٪. امسح الشفرة بمنديل ورقي نظيف أو امسح.

عندما يتم قص جميع اليرقات ، قم بتخزين اليرقات في صفيحة 96 بئرا عند 28 درجة مئوية حتى يتم تحديد أنماطها الجينية. ابدأ هذا الإجراء عن طريق إغلاق لوحة PCR المكونة من 96 بئرا والتي تحتوي على قطع الزعانف والطرد المركزي للعينات عند 1000 مرة G لمدة دقيقة واحدة. للتأكد من غمر جميع أوراق الترشيح في محلول هيدروكسيد الصوديوم.

لتحلل الأنسجة ، قم بتسخين العينات في جهاز تدوير حراري عند 95 درجة مئوية لمدة خمس دقائق. يليه التبريد إلى أربع درجات مئوية لمدة 10 دقائق. بعد ذلك ، أضف ستة ميكرولترات من 500 ملليمولار tris-HCL pH8.0 إلى كل عينة.

دوامة العينات. قم بالطرد المركزي للوحة لفترة وجيزة عند 1500 مرة G لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. لاستخراج الحمض النووي الجيني باستخدام هذه الطريقة ، قم بقص الزعنفة كما هو موضح سابقا ، ولكن أضف ورق الترشيح مع الزعنفة المقطوعة إلى بئر من لوحة PCR سعة 96 بئرا تحتوي على 30 ميكرولترا من راتنج مخلب بنسبة 5٪.

بعد قص جميع قطع الزعانف ، أغلق لوحة PCR المكونة من 96 بئرا وقم بالطرد المركزي للعينات لفترة وجيزة للتأكد من غمر جميع أوراق الترشيح براتنج المخلب. سخني العينات في جهاز تدوير حراري على حرارة 95 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة ، متبوعا بالتبريد إلى أربع درجات مئوية لمدة 10 دقائق. بإيجاز ، قم بالطرد المركزي للعينات لحبيبات حبات الراتنج والحصول على الحمض النووي في التعليق.

سيمكن اختبار تفاعل البوليميراز المتسلسل متعدد الإرسال من التمييز بين الطفرات متماثلة اللواقح ، والزيجوت المتغايرة ، واليرقات البرية. قم بإعداد تفاعل تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل كما هو مفصل في بروتوكول النص. قم بإجراء تفاعلات تفاعل البوليميراز المتسلسل في جهاز تدوير حراري 96 بئرا.

تحضير جل الاغاروز 1٪ في محلول بورات الصوديوم ، ملطخ ب 1x جل أحمر. لتسهيل العملية، استخدم نظام هلام متوافق مع الماصات متعددة القنوات إن أمكن، لتمكين إمكانات إنتاجية أعلى عن طريق تقليل الوقت اللازم لتحميل العينات. قم بتشغيل الجل في 1x مخزن بورات الصوديوم المؤقت عند 250 فولت لمدة 15 دقيقة.

قم بتصوير الجل تحت الأشعة فوق البنفسجية للسماح بالتمييز بين الأنماط الجينية المختلفة. ابدأ هذا الاختبار عن طريق تحضير اثنين من المواد الهلامية بولي أكريلاميد بنسبة 12٪ باستخدام لوحة فاصل 1.5 ملم ومشط العينة ال 15 كما هو موضح في بروتوكول النص. استخدم نظام الرحلان الكهربائي الرأسي و 1x TBE buffer كمخزن مؤقت قيد التشغيل.

بعد إجراء تفاعل البوليميراز المتسلسل كما هو موضح في البروتوكول النصي ، قم بتسخين منتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل عند 94 درجة مئوية لمدة خمس دقائق ، متبوعا بالتبريد عند أربع درجات مئوية لمدة 10 دقائق. قم بتحميل 10 ميكرولتر لكل عينة PCR ، وثمانية ميكرولترات من علامة الوزن الجزيئي. قم بتشغيل الجل عند 150 فولت لمدة ساعة واحدة ، أو حتى تصل علامة الوزن الجزيئي تقريبا إلى خط قدم الصفيحة الزجاجية.

قم بتصوير الجل تحت الأشعة فوق البنفسجية للسماح بالتمييز بين الأنماط الجينية المختلفة. تم استخدام هذا البروتوكول للنمط الجيني لنسل صليب متغاير الزيجوت ، حيث يحتوي اللفائفي المتحور على إدخال 5 أزواج أساسية في exon الطلاء الأول لجين aldh7a1. النتيجة المتوقعة من تضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل لكل من النوع البري واللفائفي الطافرة هي 434 BP amplicon.

ينشأ نطاق 293 BP من تضخيم اللفائفي المتحور ، ويتم الحصول على نطاق 195 BP للنوع البري اللفائفي. حدد تحليل تفاعلات تفاعل البوليميراز المتسلسل على هلام بورات الصوديوم 1٪ من الاغاروز الأنماط الجينية من النوع البري في الممرات الثانية والسادسة ، والأنماط الجينية المتغايرة الزيجوت في الممرات الثالثة والرابعة والخامسة ، والنمط الجيني الطافرة متماثلة اللواقح في الممر الأول. طفرات مختلفة حيث تم تنميذها الجيني عن طريق مقايسة ذوبان غير متجانسة.

تسمح كل من اللفائفي الطافرة plpbpot101 و plpbpot102 لجين plpbp بتحول الإطار وكودون التوقف المبكر. بعد التمسخ والتلدين ، ستحتوي شظايا تفاعل البوليميراز المتسلسل للحيوانات متغايرة الزيجوت على الحمض النووي غير المتجانس والمزدوج المتجانس الذي يمكن فصله وتصوره بسهولة باستخدام هلام بولي أكريلاميد. تم تحديد الأنماط الجينية الطافرة المتجانسة المركبة في الممرات الثانية والرابعة والثامنة ، والأنماط الجينية المتغايرة الزيجوت في الممرات الثالثة والسادسة والسبعة وتسعة والعاشرة ، والنمط الجيني من النوع البري في الممر الخامس.

بمجرد إتقان ، يمكن قص 96 يرقات الزعانف باستخدام هذه التقنية في أقل من ساعة ، إذا تم إجراؤها بشكل صحيح. باتباع هذا الإجراء ، يمكن تنفيذ طرق أخرى ، مثل تجميع يرقات الزرد من نفس النمط الجيني لاستخراج الأنسجة ، وطلبها للإجابة على أسئلة إضافية ، مثل التحقيق في المؤشرات الحيوية ونماذج الأمراض. بعد تطويرها ، مهدت هذه التقنية الطريق للبحث في مجال نماذج الصرع الأيضي لاستكشاف فسيولوجيا مسار المرض في أسماك الزرد.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية التنميط الجيني بشكل صحيح ليرقات الزرد البالغة من العمر ثلاثة أيام عن طريق التشريح الدقيق للزعنفة الذيلية.