تحديد تسلسل الجينات التنظيمية استخدام تسلسل الجيل المقبل من تكيف كروموسوم دائرية الفائق التقاط (ج 4-seq)

يمكن لهذه الطريقة الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال التنظيم النسخي، مثل دور التفاعلات الكروماتين. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها توفر التقاطاً غير متحيز نسبياً للتفاعلات من أجل مكان الاهتمام. على الرغم من أن هذه الطريقة يمكن أن توفر نظرة ثاقبة في التفاعلات محسن المروج، فإنه يمكن أيضا أن تطبق لتحديد أنواع أخرى من التفاعلات الكروماتين.

عموما، سوف الأفراد جديدة لهذه الطريقة النضال لأنه يأخذ عدة أيام للبروتوكول، وتصميم التمهيدي يتطلب التجربة والخطأ والتوجيه التمهيدي غير نمطية. للحفاظ على التفاعلات الكروماتين في الخلايا التي تختارها، عبر ربط لهم بإضافة 9.5 ملليلتر من 1٪ إلكتروني المجهر الصف الفورمالديهايد في برنامج تلفزيوني لكل 10 مليون خلية. احتضان الخلايا أثناء هزاز لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.

نقل أنابيب التفاعل إلى الجليد لإخماد الصليب ربط رد فعل وإضافة الجليد الباردة واحد جليسين الضرس إلى تركيز نهائي من 0.125 الضرس ومزيج من الانقلاب لطيف. بعد الطرد المركزي وغسل الخلايا وفقا لبروتوكول النص، إعادة تعليق بيليه في 125 ميكرولترات من EDTA 5 ملليمولار مع 0.5٪ SDS واحد مثبطات بروتياز X. احتضان تعليق الخلية على الجليد لمدة 10 دقائق.

للتأكد من أن الخلية هو الانتهاء، مزيج ستة ميكرولترات من الخلايا مع ستة microliters من الأزرق trypan على شريحة المجهر وتغطية مع زلة الغطاء. عرض تحت المجهر لرؤية المناطق الداخلية من الخلايا الزرقاء، والخلايا غير مبيض أبيض. لأول تقييد الهضم إضافة 30 ميكرولترات من 10 X تقييد الإنزيم العازلة، و 27 ميكرولترات من 20٪ تريتون X-100 إلى تعليق الخلية وضبط الحجم الكلي إلى 300 ميكرولترات مع الماء.

إزالة 15 ميكرولتر aliquot وتخزينها في أربع درجات مئوية كتحكم غير مهضّم. إلى ال ما تبقى ردّ فعل خليط يضيف 200 يوحّد من تقييد إنزيم واحدة. احتضان بين عشية وضحاها في درجة الحرارة المناسبة للأنزيم في كتلة التدفئة تهتز مع 900 اضطراب في الدقيقة الانفعالات.

في اليوم التالي، إضافة 200 وحدة إضافية من الانزيم ومواصلة هذا الحضانة بين عشية وضحاها. إزالة 15 ميكرولتر aliquot وتخزينها في أربع درجات مئوية كما هضم السيطرة. لتحديد كفاءة الهضم إضافة 82.5 ميكرولترات من 10 ملليمولار تريس-HCl, 7.5 pH, إلى كل الضوابط غير مهضومة وهضم.

إضافة 2.5 ميكرولترات من البروتينات K واحتضان لمدة ساعة واحدة في 65 درجة مئوية لعكس ربط عبر الفورمالديهايد. لعزل الحمض النووي المهضم، أضف 100 ميكرولترات من كلوروفورم الفينول إلى الأنبوب. مزيج من قبل العديد من التقلبات السريعة لإزالة التلوث البروتين المتبقية.

جهاز طرد مركزي عند 16، 100 غ في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق. بعد الطرد المركزي، نقل المرحلة مائي إلى أنبوب جديد. إضافة خلات الصوديوم، الجليكوجين، والإيثانول 100٪ إلى الأنبوب ومزيج بلطف عن طريق عكس.

احتضان في ناقص 80 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة لتسريع الحمض النووي. جهاز طرد مركزي الأنبوب في 16، 100 G في أربع درجات مئوية لمدة 20 دقيقة. إزالة ناظر، ثم إضافة 500 ميكرولترات من 70٪ الإيثانول لغسل بيليه الحمض النووي.

جهاز طرد مركزي عند 16، 100 غ في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق. بعد إزالة الهواء الفائق يجف بيليه في درجة حرارة الغرفة لمدة دقيقتين لإزالة الإيثانول المتبقي. إعادة تعليق بيليه المجففة في 50 ميكرولترات النوى المياه الحرة والمضي قدما لتحديد كفاءة الهضم من قبل QPCR كما هو موضح في بروتوكول النص.

للتحضير لللبلازيم، الحرارة وتنشيط إنزيم تقييد عن طريق احتضان الأنبوب لمدة 20 دقيقة في 65 درجة مئوية. ثم نقل محتويات الأنبوب إلى أنبوب مخروطي 50 ملليلتر، وإضافة نوى كللاس ماء مجاني، 10 X عازلة للليغان، و T4 الحمض النووي ligase. تخلط بلطف عن طريق دوامة، واحتضان بين عشية وضحاها في 16 درجة مئوية والمضي قدما كما هو موضح في بروتوكول النص.

لعكس ربط ربط إضافة 15 ميكرولترات من البروتينات K واحتضان بين عشية وضحاها في 65 درجة مئوية. في اليوم التالي إضافة 30 ميكرولترات من RNase A، واحتضان في 45 دقيقة في 37 درجة مئوية. للاستمرار في عزل الكروماتين، أضف سبعة ملليلترات من كلوروفورم الفينول واخلطها بعدة انقلابات سريعة.

جهاز طرد مركزي الأنبوب في 3،300 G 's في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة. بعد الطرد المركزي، نقل المرحلة المائية إلى أنبوب جديد 50 ملليلتر، وإضافة نوىليس الماء الحر، وثلاثة خلات الصوديوم الضرس، الجليكوجين، والإيثانول 100٪. اخلطي المحتويات وحضني في درجة حرارة سالبة 80 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة.

بعد الحضانة، الطرد المركزي الأنبوب في 3، 900 G في أربع درجات مئوية لمدة 20 دقيقة. إزالة عظمى، ثم غسل بيليه مع 10 ملليلتر من الجليد البارد 70٪ الإيثانول. جهاز طرد مركزي عند 3,300 جي في أربع درجات مئوية لمدة 15 دقيقة.

إزالة المناط، وتجفيف لفترة وجيزة بيليه في درجة حرارة الغرفة. قم بحل البيليت في 150 ميكرولترات من 10 ملليمولار تريس-HCl درجة ح hH 7.5 في 37 درجة مئوية. تخزين في درجة حرارة سالبة 20 مئوية أو الاستمرار في الهضم تقييد الثاني، وربط، وتنقية الحمض النووي كما هو موضح في بروتوكول النص.

بعد تنقية الحمض النووي، قم بإجراء QPCR باستخدام التمهيديات العكسية PCR وأصباغ الإنترنت و ROX لتحديد عدد دورات التضخيم لتضخيم PCR العكسي لتسلسلات التفاعل غير المعروفة كما هو موضح في النص. لإعداد الحمض النووي للتسلسل، تقليم قبالة تسلسل الطعم مع الهضم تقييد الثالث عن طريق هضم ميكروغرام واحد من المنتج النقي من PCR العكسي، فضلا عن رصد انزيم تقييد. تشغيل إنزيم تقييد هضم، أو RE رصد، على هلام agarose من تركيز مناسبة للشظايا المتوقعة.

مرة واحدة تم تحديد كفاءة الهضم من قبل الكهربائي هلام، والاستمرار مع عكس تنقية المنتج PCR وإعداد مكتبة التسلسل، كما هو موضح في بروتوكول النص. هضم القيد الثالث مهم في هذا البروتوكول لتسلسل الجيل القادم من القبض على تأكيد الكروموسوم الدائري. هذا الهضم الديكورات قبالة تسلسل الطعم الذي يمكن أن يسهل تحديد معالم الجذب الكروماتين.

Agarose جل electrophoresis من رصد RE هضم أشار الهضم كافية من المنتج PCR العكسي هضم بالتوازي. بعد الانتهاء من أربعة قراءات تسلسل C تم قطع وتعيينها إلى الجينوم مرجع بشري hg38، وذلك باستخدام حزمة برامج BWA. معظم القراءات محاذاة في مواقع تقييد الهندية الثالث أو مواقع CviQ1I المجاورة للمواقع HindiIII كما هو متوقع.

من المهم أثناء محاولة هذا الإجراء التأكد من أن الخلايا لديك مُهضومة بما فيه الكفاية. بعد هذا الإجراء، يمكن تنفيذ طرق أخرى مثل هطول الامطار المناعية الكروماتين أو CHIP، من أجل الإجابة على أسئلة إضافية مثل تحديد عوامل النسخ المشاركة في تفاعلات الكروماتين. بعد تطورها ، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في حقل الكروماتين لاستكشاف الشبكات التنظيمية المادية.