الحفاظ على الثقافات البيولوجية وقياس التعبير الجيني في نيري عافص: نظام عدم-نموذج للتفاعلات بين النبات-الحشرات

تصف هذه الطريقة الخطوات العامة لزراعة حشرات المن وخطوات التحليل الجيني لحشرات المن. يمكن تطبيق هذه الطرق للإجابة على الأسئلة الرئيسية في تطور وبيئة حشرات المن والآليات الجزيئية الكامنة وراء بيولوجيا المن. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنه يمكن تطبيقها بشكل عام على معظم أنواع المن وإجراؤها بتكلفة منخفضة نسبيا.

ابدأ بملء صينية شتلات قياسية بتربة مزيج الإنبات ، مع الحرص على وصول التربة إلى قمة الآبار. عندما تمتلئ جميع الآبار ، قم بعمل حفرة بعمق ثلاثة سنتيمترات في تربة كل بئر وضع بذرة واحدة في كل حفرة. سقي الخلايا حتى تشبع التربة التي تغطي البذور وضع الصينية في بيت زجاجي مع الري اليومي إلى كل يومين ، للحفاظ على مستوى رطوبة التربة المعتدل.

عندما تنمو الشتلات ، تملأ مجموعتها الأولى من الأوراق الكاملة أواني مستديرة بأربعة بوصات بتربة تأصيص ، حتى حوالي خمسة سنتيمترات تحت حوافها. قم بإنشاء كل في التربة بعمق كاف للوصول إلى قاع الإناء واغرف الشتلات الناضجة برفق يدويا لوضعها في عمق الثقوب الموجودة في الأواني الجديدة. بعد ذلك ، قم بتغطية الشتلات بالتربة وسقي الشتلات يوميا كل يومين للحفاظ على مستوى رطوبة التربة المعتدل.

عندما تنمو النباتات ما لا يقل عن ثلاث إلى أربع مجموعات من الأوراق الكاملة ويبلغ ارتفاعها عشرة سنتيمترات على الأقل ، افحص النباتات يدويا بحثا عن أي آفات غير مرغوب فيها واستخدم ماصة الفم لنقل حقل واحد يتكاثر بعناية تم جمع حشرة المن البالغة على ورقة النبات الأول لإنشاء خط متساوي النسيل. عندما يتم نقل جميع حشرات المن ، قم بتغطية النباتات بإحكام بقفص كوب مخصص ، وضع النباتات المصابة بالمن في غرفة بيئة خاضعة للرقابة. للحفاظ على أعداد المخزون ، استخدم ماصة الفم لنقل حوريات من الطور الثاني أو الثالث بأمان ، وحشرة من البالغة ، إلى نبات جديد على أساس أسبوعي.

وقم بتغطية كل نبتة بقفص كوب جديد للثقافة كما هو موضح. لاستخراج الحمض النووي من حشرة من شخص بالغ واحد ، ضع المن بالقرب من قاع أنبوب طرد مركزي دقيق معقم سعة 1.5 مل يحتوي على نيتروجين سائل وطحن المن بمدقة. بعد ذلك ، أضف 100 ميكرولتر من محلول التحلل إلى أنبوب الطرد المركزي الدقيق واستمر في طحن المن المسحوق حتى تتفكك العينة بشكل واضح.

اغسل المدقة ب 100 ميكرولتر إضافي من محلول التحلل ، واحتضن حشرة المن الأرضية عند 65 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. في نهاية الحضانة ، أضف 14 ميكرولترا من أسيتات البوتاسيوم aemulor إلى الأنبوب واقلبها للخلط. بعد 30 دقيقة على الجليد ، اجمع الحطام الخلوي عن طريق الطرد المركزي وانقل المادة الطافية إلى أنبوب طرد مركزي دقيق جديد سعة 1.5 مليلتر دون إزعاج الحبيبات.

أضف 200 ميكرولتر من الإيثانول البارد بنسبة 100 في المائة من الدرجة الجزيئية إلى المادة الطافية واقلب الأنبوب للخلط. بعد 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة ، اجمع الحمض النووي المترسب عن طريق الطرد المركزي ، وقم بإزالة الإيثانول بواسطة الماصة. أعد تعليق الحبيبات في 200 ميكرولتر من الإيثانول البارد بنسبة 70 في المائة من الدرجة الجزيئية مع النقر لغسل جهاز طرد مركزي ثان.

وأعد تعليق الحبيبات في 200 ميكرولتر من الإيثانول الطازج والبارد بنسبة 100 في المائة من الدرجة الجزيئية. بعد الطرد المركزي الثالث ، ضع الأنبوب أفقيا على قطعة من المناديل الورقية لتجفيفها بالهواء لمدة خمس إلى عشر دقائق. وأعد تعليق حبيبات الحمض النووي في 80 ميكرولتر من tris edta منخفض.

بعد ذلك ، حدد كمية الحمض النووي المعلق في مقياس الطيف الضوئي ، وقم بتخزين العينة المتبقية عند أربع درجات مئوية. بعد سحق ما يصل إلى خمسة حشرات من المن البالغة في النيتروجين السائل كما هو موضح ، انقل العينة إلى غطاء الدخان وأضف 800 ميكرولتر من كاشف استخراج غوانيدينيوم ثيوسيانات الفينول وكلوروفورم إلى أنبوب العينة. قم بتجانس العينة بمدقة واحتضان الجانس لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة.

بعد ذلك ، أضف 160 ميكرولترا من الكلوروفورم إلى العينة ، متبوعا ب 15 ثانية من الاهتزاز القوي باليد. بعد ذلك ، قم باحتضان العينة لمدة دقيقتين إلى ثلاث دقائق في درجة حرارة الغرفة وجهاز الطرد المركزي لجمع الحمض النووي الريبي المستخرج. لترسيب الحمض النووي الريبي ، انقل المرحلة المائية إلى أنبوب طرد مركزي دقيق جديد خال من RNS دون إزعاج المرحلة المتوسطة ، وأضف 400 ميكرولتر من الأيزوبروبانول إلى الحمض النووي الريبي.

بعد حضانة لمدة عشر دقائق عند سالب 20 درجة مئوية ، اجمع الحمض النووي الريبي المترسب عن طريق الطرد المركزي. بعد ذلك ، اغسل العينة مرتين بمليلتر واحد من 75 في المائة من الإيثانول في المياه المعالجة بثنائي إيثيل بيروكربونات ، إلى العينة مع دوامة بطيئة وطرد مركزي لإزالة أي ملوثات فينول. بعد الغسيل الثاني ، قم في الغالب بتجفيف الحبيبات بالهواء لمدة خمس إلى عشر دقائق على مقعد معقم ، وقم بإذابة حبيبات الحمض النووي الريبي في 30 ميكرولتر من الماء فائق النقاء مع سحب لطيف قبل حضانة من عشر إلى 15 دقيقة عند 55 إلى 60 درجة مئوية.

ستستغرق البذور ما يقرب من أسبوعين إلى أربعة أسابيع ، حسب الموسم ، لتنمو بشكل كبير بما يكفي لإعادة تربيتها ستستغرق الشتلات المعاد تربيتها من أسبوعين إلى أربعة أسابيع أخرى لتنمو إلى الحجم الأمثل لزراعة المن. تتميز العين القريبة من العين البالغة بزيل داكن ، وقد تكون غير مجنحة أو مجنحة.

تصبح وسادات الأجنحة النامية مرئية عندما تصل الحوريات إلى الطور الثالث. سينتج عن البالغ الواحد ما يقرب من 100 إلى 200 نانوجرام لكل ميكرولتر من الحمض النووي و 150 إلى 300 نانوجرام لكل ميكرولتر من الحمض النووي الريبي. يمكن بعد ذلك حساب التعبير النسبي للجين المرشح في ظل ظروف العلاج المختلفة.

عند محاولة هذا الإجراء ، من المهم عدم تلويث مخزوناتك متساوية النسيلة. تذكر أيضا أن جودة حشرات المن تعتمد بشكل كبير على جودة نباتاتك. باتباع هذا الإجراء ، يمكن إجراء عمليات استخراج وتقنيات تسلسل أخرى للإجابة على سؤال حول الآليات الجزيئية الكامنة وراء بيولوجيا المن.