قطره واحدة رقمي البلمرة المتسلسل لكشف شامل ومتزامن من الطفرات في المناطق الساخنة

يمكن استخدام هذه الطريقة كأداة تشخيصية للسرطان لتحليل الحمض النووي للورم المتداول. هذه التقنية تستجوب التغيير الجيني المتعدد في مناطق الطفرات العنقودية في رد فعل واحد. وهذا يساعد على حفظ عينات المريض الثمينة.

يمكن أن توفر هذه الطريقة نظرة ثاقبة لعبء الورم على ملفه الطفرة. ويمكن الآن أيضا أن تطبق على التحليل الجزيئي كبديل لـ QPCR للحصول على تحديد كمي مطلق لتسلسلات هدف الحمض النووي. جمع عينات الدم في أنابيب EDTA سبعة ملليلتر.

يوصى بأنبوبين لجمع حوالي أربعة ملليلترات من البلازما. أجهزة الطرد المركزي عينات الدم لمدة 10 دقائق في 820 مرة الجاذبية في غضون ثلاث ساعات من سحب الدم لفصل خلايا الدم الحمراء، وخلايا الدم البيضاء، والبلازما. الوقت بين أخذ العينات والطرد المركزي أمر بالغ الأهمية للحصول على عالية الجودة، والخلايا T خالية من الحمض النووي غير ملوثة بالحمض النووي الصادر من خلايا الدم البيضاء.

بعد الطرد المركزي، استخدم ماصة مصلية لجمع المابسة دون لمس طبقة خلايا الدم البيضاء. عادة ما يتم استرداد حوالي مليلتر من البلازما في أنبوب EDTA. بعد نقل البلازم إلى أنبوبين ملليلتر، الطرد المركزي aliquots في 16، 000 مرة الجاذبية لمدة 10 دقائق في 15 درجة مئوية لإزالة حطام الخلية.

جمع البلازما بعناية دون إزعاج بيليه ونقلها إلى اثنين من أنابيب المبردة ملليلتر. تخزين في درجة مئوية سلبية 80 حتى الحاجة. تبدأ بإضافة 400 ميكرولترات من البروتينات K إلى أنبوب 50 ملليلتر.

ثم، إضافة أربعة ملليلتر من البلازما و 3.2 ملليلتر من ACL تحلل العازلة التي تحتوي على ميكروغرام واحد من الحمض النووي الريبي الناقل من عدة الاستخراج. أغلق الأنبوب واخلطه عن طريق الدوامة لمدة 30 ثانية للحصول على حل متجانس. ثم، احتضان في 60 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.

بعد الحضانة، إضافة 7.2 ملليلتر من ACB العازلة إلى lysate لتحسين الربط من الأحماض النووية المتداولة إلى غشاء السيليكا. مزيج من خلال دوامة لمدة 15 إلى 30 ثانية. ثم، احتضان الأنبوب على الجليد لمدة خمس دقائق.

إرفاق العمود وموسع 20 ملليلتر على مضخة فراغ. إغلاق الأجزاء غير المستخدمة للسماح للفراغ الطموح. بعد الطرد المركزي لفترة وجيزة الأنبوب، أدخل بعناية الخليط في موسع الأنبوب.

ثم التبديل على مضخة فراغ والسماح لlysate أن يوجه من خلال الأعمدة تماما. إزالة وإزاحة موسع الأنبوب. بعد ذلك، تطبيق 600 ميكرولترات من ACW1 العازلة إلى العمود.

عندما تم رسمها ACW1 المخزن المؤقت من خلال العمود، إضافة 750 ميكرولترات من ACW2 العازلة، وأخيرا، 750 ميكرولترات من 96 إلى 100٪ الإيثانول. ثم، ضع العمود في أنبوب جمع 2 ملليلتر نظيفة وطاردة مركزية بأقصى سرعة لمدة ثلاث دقائق للقضاء على الإيثانول. بعد وضع العمود في أنبوب جمع مليلتر جديد ، افتح الغطاء ثم احتضنه عند درجة 56 مئوية لمدة 10 دقائق لتجفيف الغشاء تمامًا.

بعد الحضانة، ضع العمود في أنبوب 1.5 ملليلتر منخفض الربط. تطبيق بعناية 36 ميكرولترات من المياه الخالية من RNase مع 0.04٪ أزيد الصوديوم. ثم أغلق الغطاء واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة ثلاث دقائق.

جهاز طرد مركزي في سرعة كاملة مرة أخرى لمدة دقيقة واحدة ل elute الأحماض النووية. ثم، وتخزين في درجة مئوية سلبية 20 حتى الحاجة. تبدأ عن طريق ذوبان وتكذيب مكونات التفاعل إلى درجة حرارة الغرفة في غطاء محرك السيارة PCR نظيفة.

ثم إعداد مزيج 20 مرة من التمهيدية والتحقيقات في RNase والمياه المقطرة خالية من Dnase مع كل التمهيدي في 18 تركيز micromolar وكل مسبار في خمسة تركيزات ميكرومولار. لجميع ردود الفعل PCR الفردية، وإعداد مزيج عينة من خلال الجمع بين 10 ميكرولترات من مرتين ddPCR Supermix، وميكر واحد من 20 مرة التمهيدية ومزيج تحقيقات، وما يصل إلى 10 نانوغرام من عينة الحمض النووي في 20 ميكرولترات من الماء المقطر. دوامة تفاعل خليط بدقة لضمان التجانس.

وباختصار من الطرد المركزي لجمع محتويات في الجزء السفلي من الأنبوب قبل الاستغناء. أدخل خرطوشة ddPCR في الحامل وحمّل 20 ميكرولترات من مزيج تفاعل العينة في الآبار الوسطى للخراطيش لتوليد القطيرات. إضافة 70 ميكرولترات من زيت المولدات القطيرة في الآبار السفلية.

أدخل الكارتريدج مع طوقا في مولد القطرات. سيتم إنتاج قطرات في الآبار العليا من الخراطيش. ببطء وبلطف 40 ميكرولترات من قطرات من الخراطيش والاستغناء في لوحة PCR 96-well.

ختم لوحة PCR النهائي مع رقائق الألومنيوم باستخدام ختم لوحة مباشرة بعد نقل قطرات لتجنب التبخر. طرد مركزي لفترة وجيزة لوحة لجمع محتويات في الجزء السفلي من الآبار. تشغيل تضخيم PCR التقليدية على دورة حرارية.

عندما يتم الانتهاء من تشغيل، وطاردة مركزية لفترة وجيزة لوحة لجمع محتويات في الجزء السفلي من الآبار. بعد تضخيم PCR، استخدم قارئ القطرات لحساب PCR إيجابية وPCR قطرات سلبية بعد تعليمات الشركة المصنعة. فيما يلي نتائج تمثيلية تم الحصول عليها أثناء خطوات التحسين من المقايسة ddPCR الإنزال.

تُظهر هذه الصورة الكشف عن الحمض النووي المتحول والحمض النووي من النوع البري في تفاعل يحتوي على حمض نووي متحول بنسبة 100٪، و5٪ حمض نووي متحول، و100٪ حمض نووي من النوع البري. هذه الصورة تظهر أمثلة من عينات البلازما تحليلها مع KRAS وEGFR إسقاط المقايسة DdPCR تبين الكشف عن النيوكليوتيدات واحدة وبدائل متعددة في إكسون اثنين من KRAS وحذف في EGFR exon 19. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم المضي بعناية في كل خطوة مع اهتمام خاص في جيل القطرات ، وهي خطوة حاسمة في هذا الأسلوب.

بعد تطورها، مهدت هذه التقنية الطريق للباحث والعيادة في مجال أبحاث السرطان لتحسين تحليل طفرة الورم باستخدام خزعة سائلة.