توصيف لتمزق الأغشية البلازمية ملكل بوساطة في نيكروبتوسيس
أغسطس 7, 2018
نحن التقرير أساليب لتوصيف لتمزق الأغشية البلازمية ملكل بوساطة في نيكروبتوسيس بما في ذلك التصوير المجهري خلية العيش التقليدية و [كنفوكل]، وفحص المجهر الإلكتروني، وربط دهني المستندة إلى الرنين المغناطيسي النووي.
يمكن أن تساعد هذه الطرق في الإجابة على الأسئلة الرئيسية حول دور مجال كيناز السلالة المختلطة الزائفة مثل أو MLKL في التشريح مثل نقل الغشاء والنفاذية في ربط الدهون. الميزة الرئيسية لهذه التقنيات هي أنها تورط بشكل مباشر MLKL باعتباره الجلاد لتمزق غشاء البلازما في تشريح الأطباق. أحدث تصوير الخلايا الحية ثورة في مجال أبحاث موت الخلايا ، خاصة بالنسبة للتقرن بوساطة MLKL.
الرنين المغناطيسي النووي هو تقنية قوية لمراقبة ارتباط الدهون بالبروتينات كما هو موضح هنا ل MLKL. ابدأ بالطلاء خمس مرات 10 إلى الخلايا الليفية الجنينية للفأر بالضربة القاضية الرابعة MLKL أو MEFs التي تعبر عن مجال الجلاد ل MLKL المدمجة في شريط قلة القلة والزهرة في مليلتر واحد من DMEM المكمل في ألواح 24 بئرا لحضانة الليل في حاضنة زراعة الخلايا. في صباح اليوم التالي ، عالج الخلايا بالدوكسيسيكلين لمدة 12 ساعة للحث على التعبير عن الجينات المعدلة وراثيا ، متبوعا بإضافة DMEM القياسي المكمل بثنائي البروتين المرتبط ب FK506 وصبغة الفلورسنت الخضراء غير المنفذة للغشاء للحث على تشريح التشريح.
لمراقبة موت الخلية ، ضع اللوحة في وحدة تصوير مناسبة موجودة في حاضنة زراعة أنسجة الثدييات وافتح برنامج نظام التصوير. حدد علامة التبويب جدولة عمليات الفحص القادمة وحدد الدرج والوعاء وأنواع المسح ونمط المسح الضوئي في علامة التبويب تخطيط فعلي. حدد مضان سريع في علامة التبويب خصائص وانقر فوق نافذة المخطط الزمني والعدد الإجمالي للنقاط الزمنية وتكرار الاستحواذ لإضافة وقت المسح.
ثم انقر فوق تطبيق لبدء الحصول على الصورة. لتحديد التشريح الكمي، حدد جزء المهام وقم بتمرير مؤشر الماوس فوق خلفية عدة صور لتعيين تحليل جديد لعد الكائنات مع عتبة تجزئة ثابتة أعلى من مستوى الخلفية. بعد ذلك، حدد معاينة لفحص كائنات الفلورسنت في الصورة الحالية وتحسين مستويات العتبة حسب الحاجة.
يمكن إجراء اختيار دقيق للعتبة من خلال مراقبة الآبار المتعددة على اللوحة واستخدام ميزة المعاينة على البرنامج. فقط كن على دراية باستخدام نفس إعداد العتبة لجميع الآبار في اللوحة. لدمج أعداد التألق الأخضر، ضمن علامة التبويب بدء تحليل جديد، حدد النطاق الزمني والآبار المراد تحليلها وأدخل اسم مهمة التحليل.
ثم انقر فوق موافق وانقر نقرا مزدوجا فوق اسم الوظيفة لتصدير البيانات لإجراء تحليل إضافي في برنامج رسم بياني مناسب. لربط الدهون ل MLKL عن طريق التحليل الطيفي بالرنين المغناطيسي النووي أو الرنين المغناطيسي النووي ، استخدم محاقن محكمة الإغلاق لنقل ملليغرام واحد لكل مليلتر من الدهون الفوسفورية ذات الأهمية في قوارير زجاجية نظيفة لسلسلة معايرة الرنين المغناطيسي النووي الفردية ووضع القوارير تحت تيار غازي من الأرجون أو النيتروجين لمدة خمس إلى 30 دقيقة. يجب أن يتم توزيع الدهون من المذيبات المتطايرة مثل الكلوروفورم أو الميثانول بسرعة من المخزونات المحفوظة على الجليد الجاف من أجل تقليل التناقضات في تركيزات الدهون بين العينات بسبب تبخر المذيبات.
في نهاية فترة التبخر ، استخدم ملاقط كبيرة لترتيب القوارير في الجزء السفلي من قارورة Buchner. أغلق القارورة بسدادة مطاطية وقم بتوصيل أنابيب بلاستيكية متصلة بخط تفريغ لتفريغ محتويات القارورة تحت فراغ معتدل طوال الليل لإزالة أي مواد عضوية متبقية. في صباح اليوم التالي ، أضف المخزن المؤقت بالرنين المغناطيسي النووي المكمل بالمنظفات بالتركيز التجريبي المناسب لكل قارورة زجاجية بغشاء دهني وصوتنة القارورة في حمام مائي لمدة تصل إلى 30 دقيقة ، وإيقاف الصوتنة كل 10 دقائق للتحقق من إذابة الطبقة الدهنية.
في نهاية صوتنة ، اترك القوارير لتبرد لمدة 15 دقيقة وقم بإجراء تخفيف تسلسلي لمذيلات المنظفات الدهنية في مخزن الرنين المغناطيسي النووي الإيجابي للمنظفات ، صوتنة مخاليط 1: 1 لسلسلة التركيز المطلوبة. إعداد عينات التحكم والمرجعية بالرنين المغناطيسي النووي للبروتين والمواد المضافة في مخازن الرنين المغناطيسي النووي سالبة المنظفات وإيجابية المنظفات على التوالي ، مع إضافة البروتين والمواد المضافة إلى كل تخفيف للدهون في مخزن مؤقت إيجابي للمنظفات. بعد ذلك ، قم بنقل الحجم المناسب من العينات إلى أنابيب الرنين المغناطيسي النووي ذات الحجم المناسب وقم بتحميل العينات على جهاز الرنين المغناطيسي النووي.
يمكن ملاحظة التشريح الكامل ل MLKL-knockout MEFs في غضون ساعة واحدة من قلة القلة بوساطة ثنائي للخلايا المحتضنة مسبقا للدوكسيسيكلين التي تعبر عن الجين المعدل المنصهر. يدعم هذا التشريع الحركي السريع دور MLKL كمنفذ مفترض لتمزق غشاء البلازما ، مما يؤدي إلى إنتاج نقطة الزهرة المرتبطة بغشاء البلازما في غضون دقيقة إلى دقيقتين من العلاج باستخدام ترميز ثنائي الزهرة والزهرة لمحيط الخلية وتقريب الخلية التدريجي في غضون دقيقتين إلى ثلاث دقائق. في ظل تشريح الشعر السريع ، تغير الخلايا مورفولوجيا من شكلها الطبيعي الممدود إلى مستدير ومنتفخ في غضون خمس دقائق من قلة القلة ، وتمزق جزئيا في 10 دقائق ، ويتم تفكيكها على نطاق واسع باستخدام العصارة الخلوية المختفية في 20 دقيقة.
تكشف تجارب ربط الدهون في المختبر التي تم مراقبتها بواسطة التحليل الطيفي بالرنين المغناطيسي النووي عن تغييرات هيكلية كبيرة في بروتين مجال جلاد MLKL عند ارتباط الدهون لإزاحة منطقة الدعامة المثبطة من الحلزونية المغلقة إلى التشكل المفتوح والمضطرب جوهريا بالإضافة إلى معلومات لكل بقايا عن مخاليط كلا المطابقين. يمكن أيضا مراقبة النسب المئوية للمطابقين المغلقة والمفتوحة في عينة معينة ، مما يوفر دليلا داعما لتفاعل مجال جلاد MLKL مع الدهون الفوسفورية ويشير إلى وجود صلة مباشرة بين MLKL وغشاء البلازما. لذلك أثناء محاولة تحديد موت الخلايا باستخدام هذا الإجراء ، من المهم معرفة وتذكر أن صبغة ربط الحمض النووي لها مضان عتبة أعلى من بروتين التألق المشفر وراثيا عادة.
لهذا السبب ، يمكن استخدامها بالتوازي. لاحظ أيضا أن الدهون الميسيلار حساسة لدرجة الحرارة وبالتالي قد تحتاج درجة حرارة عينة الرنين المغناطيسي النووي إلى الأمثل. لذلك باتباع هذا الإجراء ، يمكن استخدام تقنية أخرى مثل الفحص المجهري للانعكاس الداخلي الكلي والفحص المجهري لمعالجة مدى سرعة حدوث تمزق الخلية على الخلايا التي تخضع للتشريح ومكان توطين التمزق على غشاء البلازما.
بالإضافة إلى ذلك ، يمكن إجراء الرحلان الحراري المجهري للتحقق من صحة ارتباط MLKL بالدهون الميسيلارية. مهدت التقنيات الموصوفة في هذا الفيديو الطريق للباحثين في مجال التشريح لاستكشاف دور MLKL كجلاد لتمزق غشاء البلازما. لا تنس أن العمل باستخدام الكلوروفورم يمكن أن يكون خطيرا للغاية وأنه يجب دائما اتخاذ الاحتياطات مثل ارتداء القفازات والعمل في منطقة جيدة التهوية عند تنفيذ هذا الإجراء.
اعرض النص الكامل واحصل على الوصول إلى آلاف الفيديوهات العلمية
نظرة عامة
تقدم هذه الدراسة أساليب لتمييز تمزق غشاء البلازما بوساطة MLKL أثناء نكروبتوز. تتضمن التقنيات التصوير المجهري للخلايا الحية، والتصوير المجهري الإلكتروني الماسح، وتحليل ربط الدهون المبني على الرنين المغناطيسي النووي.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- بيولوجيا الخلية
- علم الأعصاب
- آليات موت الخلية
الخلفية
- MLKL عبارة عن شبه كيناز يشارك في نكروبتوز.
- فهم دور MLKL في انتقال الغشاء ونفاذيته أمر بالغ الأهمية.
- لقد عزز التصوير المجهري للخلايا الحية البحث في موت الخلايا.
- الرنين المغناطيسي النووي فعال في دراسة تفاعلات البروتين والدهون.
هدف الدراسة
- لتوضيح دور MLKL في نكروبتوز.
- لإظهار فعالية تقنيات التصوير المختلفة.
- لتوفير بروتوكول لدراسة تمزق الغشاء بوساطة MLKL.
الطرق المستخدمة
- التصوير المجهري للخلايا الحية والتصوير المجهري المجسم الحي.
- التصوير المجهري الإلكتروني الماسح.
- اختبارات ربط الدهون المبنية على الرنين المغناطيسي النووي.
- تقنيات زراعة الخلايا التي تتضمن الخلايا الليفية الجنينية للفئران المعدلة وراثيًا لحذف MLKL.
النتائج الرئيسية
- يُعتبر MLKL المحرك لتمزق غشاء البلازما.
- يُسجل التصوير المجهري للخلايا الحية نكروبتوز بوساطة MLKL بشكل فعال.
- ينجح الرنين المغناطيسي النووي في رصد ارتباط الدهون بـMLKL.
- توفر الدراسة بروتوكولًا تجريبيًا مفصلاً لمزيد من البحث.
الاستنتاجات
- الأساليب الموضحة قيمة لدراسة نكروبتوز.
- يتم تعزيز دور MLKL كمشارك رئيسي في تمزق الغشاء.
- يمكن للدراسات المستقبلية أن تبني على هذه التقنيات لاستكشاف آليات موت الخلية.
الأسئلة المتداولة
Executive Industry Relevance
MLKL-mediated necroptosis represents a critical node in inflammatory cell death pathways relevant to autoimmunity, neurodegeneration, and oncology portfolios. Quantitative characterization of MLKL's membrane translocation and lipid binding enables mechanistic de-risking and target validation for therapeutic strategies modulating necroptosis. These methods provide predictive confidence for advancing discovery programs targeting regulated cell death.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Directly implicates MLKL as the executioner of plasma membrane rupture, clarifying pathway function.
- Enables mechanistic de-risking by visualizing MLKL redistribution and membrane permeabilization.
- Supports target validation through quantitative lipid-binding and conformational analysis.
Screening & Assay Development
- Establishes live-cell imaging and fluorescence quantification for robust necroptosis readouts.
- Standardizes segmentation thresholds and analysis pipelines for reproducible assay outputs.
- Facilitates screening of modulators affecting MLKL-lipid interactions and membrane rupture.
Translational & Preclinical Research
- Aligns mechanistic findings with disease-relevant models of inflammatory cell death.
- Enables continuity from molecular mechanism to preclinical validation of necroptosis inhibitors or activators.
- Provides quantitative endpoints for translational biomarker development.
Pipeline & Workflow Integration
These protocols integrate from early discovery through lead identification, supporting both hypothesis testing and quantitative screening of necroptosis modulators.
- Discovery Biology: Enables direct testing of MLKL function and pathway engagement via imaging and NMR.
- Screening: Provides standardized, quantitative fluorescence and lipid-binding assays for compound evaluation.
- Analytics: Delivers per-residue conformational and binding data to compare experimental conditions.
- Translational Research: Connects mechanistic insights to disease models for risk-adjusted advancement.
- Enterprise Reuse: Offers reusable imaging and NMR workflows for broader regulated cell death research.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in necroptosis pathway targeting and reduces mechanistic ambiguity.
- Operational Value: Standardizes imaging and NMR protocols for reproducibility and scalability across teams.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions for necroptosis-targeted assets and enhances capital efficiency.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of inflammatory and cell death pathway programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in live-cell imaging, fluorescence quantification, and NMR spectroscopy.
- Demands access to advanced microscopy and NMR instrumentation with analytical software.
- Necessitates cross-team standardization of segmentation thresholds and assay conditions.
- Adaptation may be needed for different cell types or lipid compositions.
- Temperature sensitivity and hazardous solvent handling must be managed per protocol guidance.
