قياس ميتوفاجي الحساسة بالتدفق الخلوي استخدام تعتمد على درجة الحموضة "مراسل الفلورسنت" طن متري-كيما

الهدف العام من هذا الإجراء هو توفير تقنية حساسة لقياس نشاط الانقسام الخلوي باستخدام قياس التدفق الخلوي. نوضح هنا أن هذه الطريقة قد استخدمت بنجاح لتقييم الزيادة الهائلة في انقسام خلايا HeLa ، بعد العلاج ب CCCP ، وهو مفك الميتوكوندريا. تسمح هذه التقنية بقياس نشاط العاثية بسرعة وسهولة كبيرة.

الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنه يمكنك قياس نشاط العاثية في الخلايا الحية بحساسية دون أي تلطيخ إضافي. لذلك ، ستكون هذه التقنية قادرة في النهاية على المساعدة في فهم الآلية والدور الفسيولوجي للعاثية العظمية. سيتم توضيح الإجراء Jee-Hyun Um و Young Yeon Kim من مختبري.

ابدأ هذا الإجراء بتحضير mt-Keima ، وهو فيروس كيما لينتي يستهدف الميتوكوندريا. HEK293T البذور الأولى الخلايا في طبق استزراع مطلي ب poly-L-lysine وزراعتها عند 37 درجة مئوية في حاضنة زراعة الأنسجة ليوم واحد. في اليوم التالي ، قم بنقل الخلايا HEK293T باستخدام الحمض النووي الفيروسي mt-Keima وتعبئة DNase باستخدام كاشف تعداء وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.

بعد ثماني ساعات من التعدي ، قم بإزالة وسائط التعداء وأضف ثمانية ملليلتر من الوسائط الطازجة. اجمع الوسائط التي تحتوي على جزيئات فيروسية بعد 48 ساعة وقم بإزالة الحطام الخلوي عن طريق الطرد المركزي. بعد ذلك ، قم بتصفية الوسائط المحتوية على الفيروسات باستخدام مرشح حقنة 0.45 ميكرومتر.

قم بتركيب خلايا HeLa-Parkin في طبق استزراع 60 ملم قبل يوم واحد من حصاد فيروس العدسات mt-Keima وزرع الخلايا بأربعة ملليلتر من وسائط النمو ليوم واحد عند 37 درجة مئوية في حاضنة. في اليوم التالي ، قم بإزالة وسط النمو ، أضف ملليمترا واحدا من وسائط فيروس mt-Keima ، أضف ملليلترين إضافيين من وسط النمو الذي يحتوي على 3 ميكرولتر من محلول مخزون البوليبرين واحتضان الخلايا ليوم واحد في حاضنة CO2. بعد 24 ساعة من الإصابة ، قم بإزالة وسائط الفيروس ، اغسل الخلايا مرتين باستخدام PBS وأضف أربعة ملليلتر من وسائط النمو.

لإزالة الخلايا غير المصابة، عالج الخلايا لمدة يومين بميكروغرامين لكل ميكرولتر من البيورومايسين. تحضير وسائط جديدة تحتوي على 10 ميكرومولار CCCP. قم بإزالة الوسائط المستنبتة وأضف أربعة ملليلتر من وسائط النمو الطازجة التي تحتوي على CCCP.

احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية في حاضنة ثاني أكسيد الكربون لمدة ست ساعات. قم بإزالة وسط النمو وغسل الخلايا مرة واحدة باستخدام PBS. افصل الخلايا عن طريق العلاج بمحلول التربسين EDTA.

اجمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي وأعد تعليقها في مليلتر واحد من PBS. انقل الخلايا في أنبوب FACS وضعها على الجليد. بالنسبة لقياس التدفق الخلوي ، قم بتشغيل مقياس التدفق الخلوي وابدأ برنامج التحليل.

قم بإنشاء تجربة جديدة وحدد BV605 لليزر البنفسجي و PE-CF594 لليزر الأصفر والأخضر في نافذة المعلمة. قم أولا بتشغيل عينة تحكم من الخلايا غير المصابة بفيروس العدسات mt-Keima. في مخطط التشتت الأمامي مقابل التشتت الجانبي ، ارسم بوابة ، باستخدام رمز المضلع ، حول الخلايا الحية وتخلص من الخلايا الميتة وحطام الخلايا.

ثم قم بتشغيل خلايا هيلا باركين المصابة بفيروس العدسات mt-Keima. في المخطط النقطي ل BV605 مقابل التشتت الجانبي ، اضبط الجهد بحيث يتم تمييز خلايا HeLa-Parkin التي تعبر عن mt-Keima بوضوح عن خلايا التحكم التي لا تعبر عن mt-Keima. بعد ذلك ، في المخطط النقطي ل PE-CF594 مقابل التشتت الجانبي ، اضبط الجهد بحيث يتم تمييز خلايا HeLa-Parkin التي تعبر عن mt-Keima بوضوح عن خلايا التحكم.

ثم في المخطط النقطي ل BV605 مقابل PE-CF594 ، حدد مجموعة الخلايا الإيجابية mt-Keima عن طريق رسم بوابة باستخدام رمز المضلع. بعد ذلك ، قم بإنشاء مخطط نقطي آخر ل BV605 مقابل PE-CF594 يظهر فقط الخلايا ذات البوابات mt-Keima. في هذه المخطط النقطي ، ارسم بوابة حول الخلايا غير المعالجة الإيجابية mt-Keima.

يشار إلى هذه البوابة باسم البوابة المنخفضة. ثم ارسم بوابة أخرى تحتوي على المنطقة فوق البوابة المنخفضة. يشار إلى هذه البوابة باسم البوابة العالية لأنها تحتوي على خلايا ذات نشاط انقسام عالي.

ثم حدد قائمة إظهار التدرج الهرمي للسكان. تمثل النسبة المئوية للقيمة الأصلية النسبة المئوية للخلايا في البوابة العالية بين السكان الإيجابيين mt-Keima. الآن قم بتشغيل كل عينة وسجل ما لا يقل عن 10 000 حدث في بوابة توقف mt-Keima.

أظهر تحليل قياس التدفق الخلوي لخلايا HeLa غير المعالجة التي تعبر عن mt-Keima مستوى انقسام انقسامي. أدى العلاج ب CCCP إلى زيادة كبيرة في الخلايا الانقسامية في البوابة العالية. زادت النسبة المئوية للخلايا الانقسامية بأكثر من 10 أضعاف بعد ست ساعات من العلاج ب CCCP.

تم إلغاء هذه الزيادة في الانقسام عن طريق علاج CCCP تماما عن طريق المعالجة المشتركة مع البابيلومايسين A.بمجرد أن تصبح الخلايا التي تعبر عن mito-Keima جاهزة ، يمكن إجراء قياس العاثية الفتية باستخدام قياس التدفق الخلوي في غضون ساعة واحدة إذا تم تحضيرها بشكل صحيح. لتحليل العاثية الدقيقة عن طريق قياس التدفق الخلوي ، من المهم إعداد البوابات العالية والمنخفضة الصحيحة. عند تحليل أنواع جديدة من الخلايا ، من الضروري استخدام خلايا معروفة مثل خلايا HeLa كعنصر تحكم.

بالإضافة إلى ذلك ، من المهم أن تتذكر أنه يجب تأكيد العاثية الفتائية بالكامل من خلال خصائص إضافية مثل انخفاض بروتين الميتوكوندريا وانخفاض الحمض النووي للميتوكوندريا. يمكن تطبيق هذه التقنية على مجموعة متنوعة من أنواع الخلايا. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تحليل العاثية عن طريق قياس التدفق الخلوي.