زراعة الواسعة النطاق على أساس لوحة ايليجانس كاينورهابديتيس: "إعداد نموذج" "دراسة التعديلات الأيضي" في مرض السكري
أغسطس 24, 2018
هذا البروتوكول وصف أسلوب لزراعة ايليجانس كاينورهابديتيس على نطاق واسع في وسائل الإعلام الصلبة. كبديل لثقافة السائل، يسمح هذا البروتوكول الحصول على معلمات جداول مختلفة المزروعة المستندة إلى اللوحة. وهذا يزيد من قابلية النتائج للمقارنة بإهمال الاختلافات المورفولوجية والأيضية بين ثقافة وسائل الإعلام السائلة والصلبة.
في مجال C.elegans ، يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية التي تتطلب إنتاج مجموعات كبيرة من الديدان الخيطية وعينات باستخدام زراعة الألواح. تتمثل المزايا الرئيسية لهذا البروتوكول في سهولة إنشائه وسهولة وصفه بما في ذلك المزالق والتطبيقات. بعد الحصول على مجموعة متزامنة من الديدان الخيطية ، أضف ما يقرب من ملليلتر واحد من M تسعة عازلة إلى الألواح ، وقم بتوزيع المخزن المؤقت بعناية عن طريق تأرجح الألواح.
بعد ذلك ، اجمع الديدان الخيطية في أنبوب سعة 15 مل. الآن ، اقلب الأنبوب واستخدم مجهرا لتقييم كثافة الديدان الخيطية. اضبط كثافة التعليق حسب الحاجة ، واستمر في تقييمه تحت المجهر.
ضع 150 ميكرولترا من التعليق مباشرة على الألواح ذات أطراف الماصة المعدلة. لضمان التوزيع المتساوي للديدان الخيطية بين الألواح ، قم بقلب أنبوب التعليق على فترات منتظمة. أولا، اغسل الديدان الخيطية باستخدام طرف ماصة معدل بحوالي 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت M تسعة.
باستخدام نفس المخزن المؤقت ، استمر في فصل الديدان الخيطية حتى يتم جمع معظم في حالة تعليق. بعد ذلك ، خذ الديدان الخيطية بطرف ماصة معدل ، وانقلها إلى طبق به OP50. تقلل أطراف الماصات المعدلة من إجهاد القص والتلف الذي يلحق بالديدان الخيطية بسبب قطرها الأكبر.
ثم اترك اللوحة تجف. قبل جمع العينات ، قم بإعداد النيتروجين السائل لتجميد الديدان الخيطية التي تم جمعها. ثم ضع M تسعة عازلة على الجليد.
ضع ملليلترا واحدا من M تسعة عازلة على كل طبق ، وقم بتدوينها برفق لغسل كل طبق. بعد ذلك ، خذ حجم M تسعة مخزن مؤقت ، وانقله إلى أنابيب جديدة سعة 15 ملليلترا. الطرد المركزي الأنبوب لفترة وجيزة عند 800 مرة جم ، قبل إزالة معظم المخزن المؤقت M تسعة.
بعد ذلك ، اغسل العينات ثلاث مرات باستخدام 10 مل من M تسعة عازلة لإزالة أي بكتيريا. باستخدام ماصة زجاجية ، انقل كل حبيبات إلى أنبوب فارغ سعة 1.5 ملليلتر. استخدم الماصة الزجاجية لتناول مليلتر واحد من المخزن المؤقت M تسعة من الأنبوب الثاني سعة 1.5 ملليلتر، لشطف الديدان الخيطية من جدار الماصة.
ثم اغسل الديدان الخيطية المتبقية من أنابيب سعة 15 ملليلتر ، وانقلها إلى أنابيب العينة. بعد ذلك ، قم بالطرد المركزي لأنابيب العينة عند 19 ، 000 مرة جم لمدة دقيقة واحدة ، وقم بإزالة أكبر قدر ممكن من المواد الطافية. بعد ذلك ، أغلق كل أنبوب بغشاء البارافين ، وقم بتجميده في النيتروجين السائل على الفور.
قم بتخزين الأنابيب على حرارة 80 درجة مئوية تحت الصفر حتى تحضير المحلل. أضف نفس الأحجام من حبات أكسيد الزركونيوم 0.5 ملم ، وضعف حجم محلول المحللة مع كوكتيل مثبط البروتيناز لكل عينة مجمدة. ثم ضع الأنابيب في الخالط لمدة دقيقة واحدة على السرعة تسعة.
الطرد المركزي للعينات لمدة 30 دقيقة عند أربع درجات مئوية ، و 19 ، 000 مرة جم. أخيرا ، انقل المادة الطافية إلى أنبوب جديد على الجليد ، وقم بتخزينها عند 80 درجة مئوية تحت الصفر للتجارب المستقبلية. في هذا البروتوكول ، تم استزراع كميات كبيرة من C.elegans للتطبيقات في أبحاث مرض السكري.
يرتبط عدد الديدان الخيطية التي تم جمعها بإنتاجية البروتين في المحللة ، مما يدل على أنه يمكن تحقيق عزل البروتين الكمي القابل للتكرار باستخدام هذا البروتوكول. يتم عرض التحليلات الطيفية الكتلية للمستقلب التفاعلي ميثيل جليوكسال ، والمنتجات النهائية المتقدمة للجليكاسیون التي تشكلت عن التعرض لميثيل جليوكسال. تمت مقارنة الديدان الخيطية المعالجة بالغلوكوز والضوابط.
يمكن أن يؤدي نقل الديدان الخيطية عبر الماصة إلى إجهاد القص ، مما قد يضر بالديدان الخيطية. لم تختلف مستويات الإجهاد التأكسدي في الديدان الخيطية الماصة والديدان الخيطية المنقولة بسلك معدني باستخدام هذا البروتوكول. باتباع هذا الإجراء ، يمكن إجراء طرق أخرى مثل اللطخة الغربية ، من أجل الإجابة على أسئلة إضافية في البروتينات.
يسهلهذا البروتوكول أيضا التجارب التي تربط معلمات متعددة بنفس السكان.
اعرض النص الكامل واحصل على الوصول إلى آلاف الفيديوهات العلمية
نظرة عامة
يصف هذا البروتوكول طريقة لاستزراع ديدان Caenorhabditis elegans على نطاق واسع في أوساط صلبة. ويسهل هذا النهج إنتاج مجتمعات وعينات كبيرة من الخيطيات، مما يعزز من إمكانية مقارنة النتائج.
المكونات الرئيسية للدراسة
مجال العلم
- علم الأعصاب
- علم الأحياء النمائي
- علم الأحياء الدقيقة
خلفية علمية
- تُعد ديدان Caenorhabditis elegans كائناً نموذجياً واسع الاستخدام.
- تتميز الزراعة القائمة على الأطباق بمزايا مقارنة بالمزارع السائلة.
- يُعد فهم ديناميكيات تجمعات النيماتودا أمراً حاسماً لمختلف التطبيقات البحثية.
- تعالج هذه الطريقة أسئلة رئيسية في مجال دراسة C.elegans.
الغرض من الدراسة
- وضع بروتوكول موثوق لزراعة *C.elegans* على أوساط صلبة.
- تمكين إنتاج مجتمعات متزامنة من الديدان الخيطية.
- تسهيل التجارب التي تتطلب أحجام عينات كبيرة.
الطرق المستخدمة
- مزامنة مجموعات الديدان الخيطية.
- إضافة محلول M nine المنظم إلى الأطباق.
- التقييم المجهري لكثافة الديدان الخيطية.
- ضبط كثافة المعلق حسب الحاجة.
النتائج الرئيسية
- التأسيس الناجح لمزارع الديدان الخيطية على نطاق واسع.
- تحسين إمكانية مقارنة النتائج المستخلصة من الاستزراع القائم على الأطباق.
- تحديد العقبات المحتملة في البروتوكول.
- التطبيقات في سياقات بحثية متنوعة.
الاستنتاجات
- يوفر هذا البروتوكول طريقة قوية لاستزراع *C. elegans*.
- وهو يعزز القدرة على إجراء تجارب واسعة النطاق.
- تتميز هذه الطريقة بكونها مباشرة وقابلة للتكرار.
الأسئلة الشائعة
الأهمية الصناعية التنفيذية
تتيح الزراعة واسعة النطاق لديدان C. elegans عزلاً كمياً قابلاً للتكرار للبروتينات من أجل اكتشاف المؤشرات الحيوية المرتبطة بمرض السكري، مما يدعم التحقق من الأهداف في المضاعفات التنكسية العصبية. توفر هذه الطريقة سير عمل قابلاً للتوسع مع تقليل إجهاد القص للتحليل البروتومي لـ AGEs و ROS، وهو أمر قابل للتطبيق المباشر في تقليل المخاطر الآلية في المراحل المبكرة من اكتشاف الأدوية. ومن خلال تسهيل تحضير مجتمع متزامن تحت ظروف محكومة، فإنها تعزز الثقة التنبؤية في النماذج قبل السريرية للاعتلالات السكرية.
التطبيقات الاستراتيجية في أبحاث وتطوير الأدوية البيولوجية
الاكتشاف المبكر والتحقق من الهدف
- القيمة العلمية: تتيح استقصاء الفرضيات العلاجية التي تربط بين التعرض للجلوكوز وتكوين نواتج glication النهائية المتقدمة (AGE) وأنواع الأكسجين التفاعلية (ROS) في النماذج العصبية.
- القيمة التشغيلية: تدعم التحقق من الهدف الوظيفي من خلال ارتباط كمية البروتين المستخلصة بعدد الديدان الخيطية بشكل قابل للتكرار.
- القيمة التنبؤية: تسهل عملية فرز المحفظة الدوائية من خلال توفير بيانات بروتيومية كمية لتحديد المركبات الواعدة في مسارات مضاعفات مرض السكري.
الفحص وتطوير المقايسة
- جاهزية المقايسة: تجهيز أنظمة بيولوجية تم التحقق من صحتها لتطبيقات لطخة ويسترن ومطياف الكتلة اللاحقة.
- قابليّة التكرار: توحيد معايير تحضير العينات لتقليل التأثير الفسيولوجي وضمان مخرجات بروتيومية متسقة.
- قابليّة التوسع: تمكين دمج تحليلات متعددة تحت ظروف استزراع متطابقة لضمان التوافق مع الفحص عالي الإنتاجية.
الأبحاث الانتقالية وما قبل السريرية
- الأهمية المرضية: يدعم دراسة مضاعفات مرض السكري من خلال نماذج *C. elegans* التي تظهر تراكم AGE و ROS بشكل مستقل عن العوامل الوعائية المربكة.
- الاستمرارية الانتقالية: يربط بين مرحلة الاكتشاف والتحقق قبل السريري من خلال تمكين تحضير عينات متسقة عبر مختلف الظروف التجريبية.
- التقدم المعدل حسب المخاطر: يوفر مستخلصات خلوية موثوقة لتحليل المؤشرات الحيوية، مما يقلل من النتائج الإيجابية الكاذبة عند تحديد أولويات الأهداف.
تكامل مسارات العمل والتدفقات الإجرائية
تندرج هذه الطريقة ضمن تسلسل عمليات الاكتشاف، بدءاً من اختبار الفرضيات، مروراً بتحديد المركبات الرائدة، وصولاً إلى التحقق قبل السريري، وهي تدعم بشكل خاص الأبحاث المتعلقة بالتنكس العصبي المرتبط بمرض السكري.
- بيولوجيا الاكتشاف: يدعم اختبار الفرضيات المتعلقة بالتغيرات الأيضية في مرض السكري من خلال التحليل الكمي للبروتينات والمستقلبات.
- الفحص المسحي: يوفر عينات جاهزة للمقايسة بكثافة موحدة وأدنى حد من إجهاد القص لضمان تقييم موثوق للمركبات.
- التحليلات: يتيح قياس methylglyoxal و AGEs بواسطة مطياف الكتلة، مما يوفر قراءات كمية لمقارنة الحالات.
- الأبحاث الانتقالية: يربط اكتشاف النمط الظاهري العصبي بالاستمرارية قبل السريرية من خلال سير عمل بروتومي متسق.
- إعادة الاستخدام المؤسسي: يؤسس منصة قابلة لإعادة الاستخدام لاستزراع الديدورات الخيطية على نطاق واسع عبر دراسات متعددة متعلقة بمرض السكري.
التأثير التشغيلي والمؤسسي
- القيمة العلمية: تزيد من الثقة التنبؤية في التحقق من الأهداف عن طريق تقليل الغموض الميكانيكي في نماذج مضاعفات السكري.
- القيمة التشغيلية: تضمن التقييس وقابلية التكرار عبر سير عمل البروتوميات، مما يقلل من التباين في تحضير المستخلصات الخلوية.
- القيمة الاستراتيجية: تحسن قرارات المتابعة أو الإيقاف من خلال بيانات موثوقة للمؤشرات الحيوية، مما يقلل من المخاطر البيولوجية في المراحل المتأخرة من برامج السكري.
- تأثير المحفظة: تتيح تحديد أولويات الأهداف بناءً على تقييم المخاطر، استناداً إلى بيانات قابلة للتكرار حول تعديل AGE و ROS.
اعتبارات التنفيذ
- يتطلب خبرة في التعامل مع ديدان C. elegans وتقنيات المزامنة.
- يستلزم الوصول إلى أجهزة الطرد المركزي، والمجانسات، والنيتروجين السائل لمعالجة العينات.
- يتطلب توحيداً بين الفرق في تقييم كثافة المعلق وبروتوكولات الغسيل.
- يتضمن اعتبارات التكيف عند النقل بين الأطباق ذات الظروف التجريبية المختلفة.
- يشمل قيوداً عملية تتعلق بتخفيف إجهاد القص أثناء خطوات الماصة، والتي يتم معالجتها باستخدام رؤوس ماصات معدلة.
الأسئلة الشائعة حول المستحضرات الصيدلانية الحيوية
Chapters in this video
0:04
Title
0:27
Large Scale Culture on Plates
1:15
Transfer of Large Amounts of Caenorhabditis elegans
1:52
Harvest of a Large Caenorhabditis elegans Sample
3:20
Protein Isolation for Mass Spectrometry
3:56
Results: Reproducible Quantitative Protein Isolation and Further Applications of Large-scale C. elegans Culture
4:47
Conclusion
