البروتين الذاتية في الإنسان التي يسببها الخلايا الجذعية Pluripotent باستخدام كريسبر/Cas9

الهدف من هذا البروتوكول هو توليد خلايا جذعية متعددة القدرات المستحثة عن الإنسان والتي تعبر عن بروتينات الاندماج الذاتية المدمجة لنهاية علامات الفلورسنت الطرفية N أو C. لتحقيق الضربة المرغوبة ، نستخدم نظام CRISPR-Cas9 ونهج قائم على البروتين النووي الريبي باستخدام بروتين S.pyogenes Cas9 من النوع البري وCRSPR RNA و tracrRNA اصطناعي مكون من جزأين. يتم تسليم RNP هذا بشكل مشترك مع تسلسل علامة الفلورسنت المطلوب كبلازميد متبرع عبر التثقيب الكهربائي.

يتم إثراء الخلايا التي تم تحريرها بشكل مفترض والتي تعبر عن البروتين الموسوم بالفلورسنت بواسطة FACS. ثم يتم إنشاء الخطوط النسيلة لتحليل نتائج التحرير الدقيقة. يتمتع بروتوكول تحرير الجينات هذا بالعديد من المزايا مقارنة بالتركيبات التقليدية للإفراط في التعبير.

نظرا لإدخال علامة الفلورسنت في الجينوم ، يمكن دراسة التوطين الخلوي تحت الخلوي وديناميكيات بروتين الاندماج الناتج تحت السيطرة التنظيمية الذاتية. نستخدم هنا الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات كنظام نموذجي لأنها تسمح لنا بدراسة البروتينات الموسومة في الخلايا ثنائية الصبغيات غير المحولة. بالإضافة إلى ذلك ، نظرا لأنه يمكن تمييز الخلايا إلى أنواع متعددة من الخلايا ، مثل خلايا عضلة القلب الموضحة هنا ، فإن هذا النهج يوفر الفرصة لإنشاء ودراسة البروتينات الموسومة في مجموعة متنوعة من السياقات الخلوية متساوية الجين.

ومع ذلك ، مع التحسين الدقيق ، يمكن تكييف هذا البروتوكول لتحرير جينومات أنواع خلايا الثدييات الأخرى. مرحبا ، أنا أماندا هاوبت ، أنا جزء من فريق الخلايا الجذعية وتحرير الجينات هنا في معهد ألين لعلوم الخلايا. اليوم ، استخدمنا هذا النهج لتوليد أكثر من 35 خطا خلويا مختلفا تعبر عن بروتينات الاندماج الذاتية.

نحن نستخدمها لدراسة مجموعة متنوعة من الهياكل والعمليات الخلوية الفريدة. لقد نجح هذا النهج لما يصل إلى 95٪ من المواقع التي تمت تجربتها حتى الآن مع مجموعتنا. ستكون هذه الطريقة مفيدة بشكل خاص لعلماء الأحياء الخلوية المهتمين بفهم ديناميكيات البروتين في الخلايا الحية بشكل أفضل.

ومع ذلك ، بمجرد إنشاء الخطوط النسيلة المعدلة ، تصبح إمكانيات الدراسة لا حصر لها. باستخدام هذه الطريقة ، يمكننا تحديد المستنسخة التي تحتوي على علامات بروتين فلوري أحادي الأليلات باستمرار دون أي اضطرابات أخرى في التسلسل الجيني. يمكننا أيضا في بعض الأحيان الحصول على نسخ معدلة ثنائية.

سنعرض في هذا الفيديو بعض الخطوات الرئيسية في تعدين وتثري FACS وعزل خطوط الخلايا النسيلة التي تعبر عن بروتينات الاندماج الفلوري المنظمة داخليا. قبل ساعتين إلى ثلاث ساعات من التعدي ، عالج hiPSCs بعشرة مثبطات ميكرومولار روك مكملة في وسط النمو. سيؤدي ذلك إلى تعزيز البقاء على قيد الحياة بعد التثقيب الكهربائي.

سيكون للخلايا مظهر شائك بعد هذا العلاج. يجب إزالة الخلايا من لوحة إغلاق الأنسجة باستخدام منطقة تفكك خلية واحدة وتجميع تعليق الخلية في أنبوب مخروطي قبل التعدين. قم بإعداد حصة 1.84 في 10 إلى الخلايا الست لكل حالة تجريبية يتم نقلها.

قم بإعداد أنابيب معقدة للبروتين النووي الريبي لكل تعداء عن طريق إضافة 2.88 ميكرولتر من 10 ميكرومولار دليل RNA و 2.88 ميكرولتر من 10 ميكرومولار Cas9 إلى أنبوب 1.5 مل. احتضن في درجة حرارة الغرفة لمدة لا تقل عن 10 دقائق ، بحد أقصى ساعة واحدة. حبيبات الخلية aliquot المحضرة في الخطوة السابقة عند 211 مرة G لمدة ثلاث دقائق في درجة حرارة الغرفة.

ثم استنشق المادة الطافية وتسابق لتدوير حبيبات الخلية في 220 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتثقيب الكهربائي. أضف 220 ميكرولترا من الخلايا العالقة المعاد إعادتها إلى الأنبوب المركب 1.5 مل RNP المعد مسبقا. أضف 4.6 ميكرولتر من ميكروغرام واحد لكل بلازميد متبرع بالميكرولتر.

استخدم طرف النواة والماصة لخلط المحتويين مرتين إلى ثلاث مرات ثم انقل مائة ميكرولتر من التعليق إلى جهاز التثقيب الكهربائي المجهز. تجنب إدخال أي فقاعات في الحافة. ضع ثلاثمائة فولت لنبضة واحدة مدتها ثلاثون مللي ثانية.

انقل التعليق برفق إلى صفيحة جاهزة من ستة آبار بحركة دوامة. قم بتفريق الخلايا عن طريق تحريك اللوحة برفق من جانب إلى آخر ومن الأمام إلى الخلف. بعد التكرار لجميع الظروف التجريبية والضوابط ، احتضان الخلايا المنقولة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2 لمدة 24 ساعة لتغيير الوسائط إلى وسائط نمو منتظمة بدون مثبط ROCK في 24 ساعة.

ثم استمر في إطعام hiPSCs كل 24 ساعة لمدة 72 إلى 96 ساعة لمراقبة التقائها. عندما تصل hiPSCs إلى التقاء 68 إلى 80٪ ، انتقل إلى تخصيب FACS. قبل ساعتين إلى ثلاث ساعات من التعدي ، عالج hiPSCs ب 10 مثبطات ميكرومولار ROCK المكملة في وسط النمو لتعزيز البقاء على قيد الحياة بعد تخصيب FACS.

لفرز الخلايا ، قم بإزالتها من اللوحة باستخدام كاشف تفكك الخلية المفردة ثم قم بتصفية تعليق hiPSC من خلال مرشح شبكي 35 ميكرون إلى أنابيب ذات قاع دائري من البوليسترين. قم بفرز الخلايا باستخدام التشتت الأمامي والمبعثر الجانبي بما في ذلك:height مقابل العرض والحطام الثلاثي والمزدوجات. استخدم خلايا التحكم في المخزن المؤقت المباشر فقط لتعيين بوابة FP الموجبة مثل أن أقل من 1.1٪ من الخلايا المؤقتة فقط تقع داخل البوابة.

عند فرز الخلايا الجذعية ، قم بتكييف إعدادات الجهاز لتعزيز بقاء الخلية كما هو مقترح في قسم المناقشة. يمكن أن تتراوح الضربة النموذجية في الكفاءات كما تحددها النسبة المئوية للخلايا الإيجابية FP بواسطة FACS في أي مكان من 0.1٪ إلى 5٪ فرز الخلايا في أنبوب بولي بروبيلين من 1.5 إلى 15 مل يحتوي على 0.5 إلى 2 مل من وسائط النمو في درجة حرارة الغرفة مكملة بمثبطات ROCK 10 ميكرومولار. الطرد المركزي للخلايا المجمعة عند 211 مرة G لمدة ثلاث دقائق في درجة حرارة الغرفة.

قم بشفط المادة الطافية بعناية وأعد تعليق حبيبات الخلية في 200 ميكرولتر من وسائط النمو المكملة ب 10 مثبطات ROCK ميكرومولار. انقل ما يصل إلى ثلاثة آلاف خلية متنوعة إلى بئر واحد من لوحة 96 بئر مطلية ب matrigel طازجة. احتضان الخلايا المصنفة عند 37 درجة مئوية في 5٪ CO2 لمدة 24 ساعة ، وتغيير الوسائط إلى وسائط نمو مكملة ب 5 مثبطات ROCK ميكرومولار في 24 ساعة.

ثم في 48 ساعة ، استمر في تغذية الخلايا بوسط نمو منتظم ، ولا يوجد مثبط ROCK كل 24 ساعة لمدة 72 إلى 96 ساعة لمراقبة التقاء. بمجرد أن تنضج الخلايا بما يكفي ليتم إخراجها من صفيحة البئر 96 ، نوصي بتمريرها تدريجيا إلى ألواح أكبر. لذلك على سبيل المثال من بئر واحد من 96 بئر ، انقلها إلى بئر واحد إلى بئرين من صفيحة 24 بئرا.

ثم من هناك إلى صفيحة مكونة من 6 آبار ، وما إلى ذلك ، حتى يكون لديك خلايا كافية لأغراض المصب. عادة ما يكون ثلاثة إلى أربعة ملايين خلية كحد أدنى. لتوليد خطوط نسيلة من السكان المخصب FACS من الخلايا المعدلة عقابية ، قم بالمرور إلى معلق خلية واحدة ولوحة عشرة آلاف خلية على صفيحة 10 سم والسماح للمستعمرات بالنمو لمدة خمسة إلى سبعة أيام.

عندما تكون المستعمرات مرئية من الناحية المجهرية ، تكون كبيرة بما يكفي ليتم عزلها. على مجهر التشريح ، استخدم ماصة P200 لكشط المستعمرات الفردية وشفطها برفق من سطح اللوحة. انقل الحجم الذي يحتوي على المستعمرة إلى بئر واحد من لوحة البئر 96.

بعد نقل جميع المستعمرات ، احتضن اللوحة في حاضنة زراعة الأنسجة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2 لمدة 24 ساعة. قم بتغيير الوسائط إلى وسائط نمو منتظمة بدون مثبط ROCK في 24 ساعة. ثم استمر في تغذية الخلايا كل 24 ساعة لمدة 72 إلى 96 ساعة حتى يتضاعف حجم المستعمرات ثلاث مرات تقريبا.

ستحتاج الخلايا إلى النمو والمرور في 96 لوحة بئر من أجل الحصول على خلايا كافية لحفظ الانتاليز بالتبريد لاستخراج الحمض النووي الجيني. راجع البروتوكول المكتوب لمزيد من التفاصيل. للمرور في 96 لوحة بئر ، استخدم شفاطة ثماني قنوات لإزالة الوسائط وتجاهلها من العمود الأول.

باستخدام ماصة P200 متعددة القنوات، أضف حوالي 200 ميكرولتر من DPBS إلى العمود الأول من اللوحة لغسل الخلايا. باستخدام شفاط ثماني قنوات ، قم بإزالة وتجاهل غسيل DPBS من العمود الأول. ثم أضف 40 ميكرولترا من كاشف التفكك إلى العمود الأول.

كرر هذه الخطوات بعمل عمود واحد في كل مرة لما يصل إلى ستة أعمدة من لوحة البئر 96. قم بتغيير النصائح للتأكد من عدم عبور الآبار الملوثة. ضع اللوحة في الحاضنة لمدة ثلاث إلى خمس دقائق من وقت إضافة كاشف التفكك إلى العمود الأول.

عندما تبدأ الخلايا الموجودة في العمود الأول من اللوحة في الرفع عن القاع، استخدم ماصة P200 متعددة القنوات لإضافة 160 ميكرولترا من DPBS إلى العمود الأول وقم بترتيبات الخلايا برفق في مواضع موضع الساعة 12 والساعة 3 والساعة 6 والساعة 9 لكل بئر. انقل الحجم بالكامل مع تعليق الخلية إلى لوحة بئر V-bottom 96. كرر هذه الخطوات للأعمدة المتبقية التي تحتوي على كاشف تفكك فيها ، وقم بتغيير النصائح حتى لا تلوث الآبار.

قم بتدوير اللوحة السفلية على شكل حرف V في جهاز الطرد المركزي عند 385 مرة G لمدة ثلاث دقائق في درجة حرارة الغرفة. يتم تنفيذ الجزء الفرعي الذي يظهر حتى هذه النقطة لمرور 96 بئر بنفس الطريقة في أي وقت يتم فيه تمرير الخلايا في تنسيق اللوحة هذا. بعد ذلك سنوضح لك كيفية المتابعة إذا كنت مستعدا لحفظ الخلايا بالتبريد بتنسيق 96 جيدا.

راجع البروتوكول المكتوب لمزيد من المعلومات. بعد خطوة الطرد المركزي الموضحة في القسم السابق، قم بشفط المادة الطافية باستخدام ماصة P200 متعددة القنوات ثم أعد تعليقها في 60 ميكرولترا من وسائط النمو المكملة بمثبط ROCK 10 ميكرومولار. كرر لجميع الآبار ، وقم بتغيير النصائح حتى لا تتلوث.

انقل 30 ميكرولترا من تعليق الخلية إلى لوحة زراعة أنسجة 96 بئر غير مطلية ب 96. انقل 30 ميكرولترا المتبقية من التعليق إلى لوحة شقيقة ثم أضف بسرعة 170 ميكرولترا من مخزن التجميد إلى كل بئر دون خلط. لاحظ أن هذه العملية تتم في لوحات شقيقة مكررة بحيث توجد مجموعة احتياطية من الخلايا بعد إذابة إحدى الألواح الفردية.

يسمح وضع الخلايا المحفوظة بالتبريد في كل عمود آخر فقط من لوحة البئر 96 بإذابة الجليد بشكل أسرع. لف الطبق بالبارافيلم وضعه في صندوق ستايروفوم بدرجة حرارة الغرفة بغطاء. ضع الصندوق بالكامل في الفريزر 80 درجة مئوية تحت الصفر.

بعد 24 ساعة ، يمكن نقل الأطباق من صندوق الستايروفوم وفرزها عند 86 درجة مئوية تحت الصفر لمدة تصل إلى أربعة أسابيع. يسمح الحفظ بالتبريد للخلايا الجذعية متعددة القدرات المستحثة البشرية في شكل 96 بئر بكسر زمني في زراعة الخلايا. يمكن للباحث إجراء فحوصات التحقق الجينومي على المناجم النسيلة لتحديد المستنسخة المرغوبة وراثيا لإذابة الجليد للدراسات المستقبلية.

بعد أربعة أيام من نقل خط WTC hiPSC ببروتين RNA Cas9 الدليل المحدد المستهدف وبلازميد قالب المتبرع المصمم بعناية ، لوحظ أن 0.95٪ من الخلايا تعبر عن GFP. تم استخدام FACS لفرز جميع الخلايا الإيجابية ل GFP كمجموعة سكانية مخصبة. كشفت دراسات الفحص المجهري الأولية عن التوطين المتوقع لبروتين اندماج لامين B1 النووي mEGFP إلى الغلاف النووي.

لوحظ البروتين المسمى بالفلورسنت في حوالي 95٪ من الخلايا بكثافة متفاوتة. بعد توليد الخط النسيلي ، تم الحصول على المستنسخة ذات كثافة mEGFP الموحدة وتحليلها بشكل أكبر للتحرير الدقيق. في الختام ، أظهرنا طريقة تعداء لتحرير الجينات للخلايا الجذعية متعددة القدرات المستحثة البشرية للتعبير عن بروتينات الاندماج الفلوري المنظمة

نظرا لأن أوجه القصور النموذجية منخفضة ، فإن بعض استراتيجيات التخصيب مثل طريقة FACS الموضحة هنا تؤدي إلى مجموعة من الخلايا المفترضة المعدلة التي تعبر عن بروتين الاندماج. يمكن استخدام السكان المخصبين للدراسات البيولوجية أو يمكن إنشاء خطوط نسيلة كما هو موضح في هذه الطريقة مما يجعل من الممكن تحديد خطوط الخلايا التي يتم تحريرها بدقة جينيا. من المهم أن تتذكر أن فواصل الخيوط المزدوجة المستحثة عن Cas9 في الجينوم غالبا ما يتم إصلاحها بشكل غير دقيق على الرغم من دمج العلامة في الموضع المقصود.

بالإضافة إلى ذلك ، في المستنسخة المعدلة أحادية الأنظار ، غالبا ما يحتوي الأليل غير الموسوم على indels ناتجة على الأرجح عن إصلاح الانضمام النهائي غير المتماثل. تؤكد هذه النتائج على أهمية التحقق الجيني بعد أن تم الكشف عن ضربة CRISPR Cas9 فقط من خلال تحليل جينوم خطوط الخلايا النسيلية. لا يضمن التعبير عن بروتين الاندماج المتوقع وحده التحرير الدقيق.

عند استخدام هذا البروتوكول لتحرير الخلايا الجذعية متعددة القدرات المستحثة البشرية ، احرص على اتباع التوصيات المفصلة في البروتوكول المكتوب لضمان التعامل اللطيف مع الخلايا من أجل بقاء الخلية على النحو الأمثل والحد الأدنى من التمايز التلقائي. نأمل أن يساعدك هذا الفيديو والبروتوكول وقائمة المواد المرتبطة به في إجراء تجارب مماثلة في مختبرك الخاص على البروتين المفضل لديك. شكرا للمشاهدة.