تقييم الواجهة متشابك لخلايا تي البشرية الأولية من الدم والأنسجة اللمفاوية

تم اشتقاق النهج الذي سنتحدث عنه اليوم لمقارنة الخصائص والأنشطة الوظيفية لخلايا الدم التائية المشتقة من الأنسجة والمحيطية. تتجلى أهمية الموضوع في حقيقة أن الخلايا التائية في الدم المحيطي تمثل 20٪ فقط من إجمالي الخلايا التائية في الجسم. إن القدرة على دراسة عدد صغير من الخلايا التائية المشتقة من الأنسجة أمر ضروري للغاية ، وهذا بالضبط ما حققناه.

الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تتطلب عددا أقل من الخلايا وكميات أقل من الكواشف مقارنة بالتقنيات التقليدية. ابدأ باستخدام ملقط من نوع مقص البولي بروبلين لغمر الأغطية الزجاجية في محلول سمكة المفترسة الحمضية المحضرة حديثا لمدة 25 إلى 30 دقيقة. في نهاية الغسيل، اشطف الغطاء سبع مرات بكمية منعشة من الماء فائق النقاء لكل غسلة.

ثم ضع الغطاء المبلل جانبا للسماح للماء المتبقي بالتدحرج من الزجاج النظيف. عندما تجف الغطاء ، قم بتجميع ميكرولترين من خليط الجسيم الشحمي النهائي بدقة في وسط قناة منزلقة ذاتية اللصق داخل غطاء تدفق معقم. وعلى الفور ولكن بعناية قم بمحاذاة غطاء نظيف وجاف مع الشريحة للسماح بإنزال الغطاء برفق على الجانب اللاصق من الشريحة.

واستخدم الحلقة الخارجية لملقط من نوع مقص البولي بروبلين لتطبيق ضغط لطيف على التلامس المحيطي للغطاء مع الشريحة ، مع التأكد من أن الانزلاق متصل بإحكام بالشريحة لمنع التسرب. ثم اقلب الشريحة ، واستخدم علامة دائمة لرسم أربع نقاط حول الطبقة الثنائية على الجانب الخارجي لمجموعة الشريحة. قبل الحقن الأول ، قم بتعيين منفذ واحد من القناة كمنفذ دخول ، والآخر كمنفذ خروج ، مع الحفاظ على هذا التعيين طوال التجربة.

لتجنب تكون الفقاعة، أدخل طرف طرف الماصة مباشرة في منفذ الدخول حتى تشعر بالختم المطاطي لقناة الانزلاق يتم اختراقه بالطرف. املأ القناة ببطء ب 50 ميكرولتر من المخزن المؤقت للفحص الدافئ. حقن 200 ميكرولتر من كلوريد النيكل (II) في محلول حجب الكازين في منفذ الدخول.

وقم بإزالة 50 ميكرولتر من المخزن المؤقت من منفذ الخروج. بعد حضانة لمدة 45 دقيقة ، قم بإزالة محلول الكازين الزائد من منفذ الخروج. حقن 100 ميكرولتر من ICAM-1 في محلول الستربتافيدين في منفذ الدخول لمدة 45 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.

في نهاية الحضانة ، قم بإزالة محلول البروتين الزائد من منفذ الخروج. واغسل الطبقة الثنائية مرتين باستخدام 100 ميكرولتر من مخزن الفحص المؤقت لكل غسلة. ثم قم بتسمية الطبقات الثنائية ب 100 ميكرولتر من الجسم المضاد المضاد ل CD3 المترافق بالفلورو 4 لمدة 45 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.

تليها غسلتان في 100 ميكرولتر من مخزن الفحص لكل غسلة كما هو موضح. لتصوير تفاعلات الخلايا التائية ثنائية الطبقة ، ضع الشريحة على المرحلة الساخنة بزاوية 37 درجة مئوية من تألق الانعكاس الداخلي الكلي ، أو مجهر TIRF. واضبط المرحلة باستخدام علامات الحبر لتوسيط الطبقة الثنائية على هدف 100 قوة.

لتصوير إطلاق الحبيبات ، أضف شظايا الجسم المضاد المضاد ل CD107A المترافق بالفلورة إلى تعليق الخلايا التائية CD4. وأعد تعليق الخلايا المسماة في 50 ميكرولترا من المخزن المؤقت للفحص للحقن في منفذ دخول قناة الشريحة. ثم حدد العدد المناسب من الحقول التجريبية ، وسجل الصور لكل حقل مرة كل دقيقة لمدة 30 دقيقة بعد الحقن.

في هذه التجربة التمثيلية ، لم يتم ملاحظة أي اختلافات بين خلايا CD8 T التي شكلت نقاط الاشتباك العصبي المناعية الكلاسيكية على الطبقات الدهنية الثنائية المبنية إما في خلية التدفق أو شريحة التدفق متعددة القنوات. عند تفاعل ثنائي الطبقة الدهنية ، أنشأت خلايا CD4 T نقاط اشتباك عصبي مناعية ناضجة ، ولكنها إما تطلق حبيبات أو لا تطلق حبيبات ، أو تطلق حبيبات دون تكوين نقاط اشتباك عصبي ناضجة ، أو لا تشكل نقاط الاشتباك العصبي ولا تطلق حبيبات. وتجدر الإشارة إلى أن خلايا CD4 التائية أحادية النواة المشتقة من الخلايا المحيطية في الدم المحيطي قادرة على البدء في إطلاق الحبيبات بأسرع مرتين تقريبا مثل خلايا CD4 المشتقة من العقدة الليمفاوية.

أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم الحفاظ على درجة حرارة ثابتة وسحب العينات ببطء حتى لا تتشكل فقاعات. بالإضافة إلى قدراتنا على التحقيق في واجهة ثنائية الطبقة للخلايا التائية ، سيسمح لنا هذا النهج أيضا بإجراء تلطيخ بين الخلايا للخلايا التائية التي لامست الطبقة الثنائية. مما يسهل بشكل كبير كمية من المعلومات التي يمكن استخدامها لوصف خلايا تائية معينة مشتقة من الأنسجة اللمفاوية أو الأنسجة الأخرى.

لا تنس أن العمل مع محلول سمكة الضاري المفترسة أمر خطير للغاية ، ومن الأهمية بمكان أن ترتدي معدات الوقاية الشخصية المناسبة أثناء محاولة هذا الإجراء.