نهج في المختبر للعلاج الضوئي

يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية حول العلاج الضوئي الديناميكي ، المعروف أيضا باسم PDT. تشمل الأسئلة التي يمكن الإجابة عليها باستخدام هذه الطريقة مدة حضانة المحسس للضوء ، أو استخدام معلمات مختلفة في التجربة مثل تغيير درجة الحرارة عن طريق تسخين الخلايا أو تبريدها. يمكن أن تساعد هذه التقنية في تسهيل التطوير في المختبر لمستشعر الضوء والبروتوكولات والمؤشرات الجديدة ل PDT.

ابدأ بالطلاء مرتين في 10 إلى الخلايا الرابعة في ملليلترين من وسط الاستزراع في كل بئر من ستة آبار باستخدام تقنية معقمة لحضانة لمدة 24 ساعة عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون. في اليوم التالي ، اغسل الخلايا بما لا يقل عن ملليلترين من PBS وعالج الثقافات بتخفيفات صفر أو صفر نقطة خمسة أو واحد أو ملليمترين من 5-ALA المحضرة حديثا. ثم ضع اللوحة على كتلة تسخين 36-37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة محمية من الضوء.

أثناء الإجراء ، نوصي خلال مرحلة الحضانة بأن يستخدم الباحثون كتلة تسخين لتحقيق درجة حرارة ثابتة طوال فترة الحضانة. بالإضافة إلى ذلك ، نوصي بتغطية الخلايا خلال فترة الحضانة بورق الألمنيوم لمنع تنشيط إيرل للحساس الضوئي. في نهاية الحضانة ، اغسل الخلايا في كل بئر بملليلترين من PBS.

وقم بتحديث الثقافات بملليلترين من وسط الثقافة الطازجة لإشعاع الضوء الأزرق. قبل تشعيع الخلايا ، قم بتسخين جهاز الضوء الأزرق بطول موجي خرج 417 نانومتر لدورة واحدة مدتها 1 ، 000 ثانية واستخدم مقياس ضوئي لقياس الإشعاع على سطح الخلية ، وضبط مسافة الضوء لتحقيق الإشعاع المناسب وفقا لشدة مصدر الضوء. ثم ضع الخلايا المعالجة 5-ALA على سطح أسود تحت الضوء الأزرق لمدة 1000 ثانية للحصول على طلاقة إجمالية تبلغ 10 جول لكل سنتيمتر مربع.

أثناء تنشيط الصورة ، نوصي بوضع الخلايا على سطح أسود لمنع انعكاس الضوء والجرعات غير المتسقة. في نهاية العلاج بالضوء ، اغسل الخلايا في كل بئر بملليلترين من PBS وافصل الخلايا بمليلتر واحد من 0.25٪ تريبسين-EDTA لكل بئر. بعد ثلاث إلى خمس دقائق ، قم بتأكيد الانفصال وإلغاء تنشيط التربسين باستخدام 10٪ FBS و PBS.

انقل الخلايا من كل بئر إلى أنابيب تدفق فردية سعة خمسة ملليلتر وجمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي. أضف 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتدفق مع الجسم المضاد المترافق الملحق V لكل عينة. أعد تعليق الخلايا ووضع الأنابيب في الحاضنة لمدة 20 دقيقة للسماح بالربط الملحق V.

في نهاية الحضانة ، أضف ثلاثة ميكرولترات من 7-AAD إلى كل عينة واحتضانها مرة أخرى في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق متبوعا بتحليل العينة الذي يتم إجراؤه وفقا لبروتوكولات تحليل التدفق الخلوي القياسية. بعد خمسة علاجات بالضوء ALA والضوء الأزرق ، لوحظت زيادة تعتمد على الجرعة في موت الخلايا المبرمج. لحساب النسبة المئوية للخلايا التي تخضع لموت الخلايا المبرمج ، تتم إضافة النسبة المئوية للخلايا في الأرباع المرتفعة في الملحق الخامس ، و 7-AAD المنخفضة ، والملحق الخامس المرتفع ، و 7-AAD العالية.

قد تؤدي التناقضات في طول فترة حضانة ALA الخمس أو درجة حرارة الحضانة أو جرعة تشعيع التنشيط الضوئي إلى تغيير فعالية العلاج بالضوء ، مما يؤدي إلى زيادة تعتمد على درجة الحرارة في موت الخلايا المبرمج ، على سبيل المثال. بعد هذا الإجراء ، يمكن إجراء تقنيات أخرى بما في ذلك RTQPCR واللطخة الغربية لتحديد كيفية تغيير PDT للتعبير الجيني ونشاط البروتين. تسمح هذه الطريقة للباحثين المهتمين بالعلاج الضوئي الديناميكي باكتشاف التأثيرات على خلايا سرطان الجلد والأمراض الجلدية الأخرى في المختبر.