أساليب لتقييم دور ج-المنحدر و Dusp1 في الاعتماد على السرطاني
يناير 7, 2019
هنا، يمكننا وصف بروتوكولات المصادقة الوراثية والكيميائية ج-المنحدر و Dusp1 كهدف المخدرات في سرطان الدم باستخدام الماوس الوراثية وأنسنة في المختبر والمجراه في نماذج. يمكن تطبيق هذا الأسلوب لأي هدف للتحقق من الصحة الوراثية والتنمية العلاجية.
يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجالات علاجات السرطان ، مثل تحديد الجينات الرئيسية المشاركة في الاعتماد على الـ oncogene. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هو أنه يستخدم الاعتماد على الولكوجين التي هي مشتركة لكثير من أنواع السرطان التي يحركها كيناز ولذلك فإنه ينطبق على أنواع متعددة من الأورام. على الرغم من أن هذه الطريقة يمكن أن توفر نظرة ثاقبة في سرطان الدم، ويمكن أيضا أن تطبق على أنظمة أخرى، مثل الأورام الصلبة مثل سرطان الرئة، وأورام الدماغ، وأورام البنكرياس.
عموما، سوف الأفراد جديدة لهذه الطريقة النضال بسبب نقص الخبرة في علم الأحياء الجزيئية وعلم وظائف الأعضاء الخلوية. للبدء، حصاد عظام الساق من فأر القتل الرحيم. تنظيف الأنسجة من العظام مع مشرط.
ثم ضع العظام في PBS الباردة على الجليد وسحق العظام مع الحشرات. بعد هذا، تصفية تعليق الخلية من خلال مصفاة خلية ميكرومتر 70 في أنبوب قبعة المسمار 50 ملليلتر مع ماصة 10 ملليلتر. غسل هاون وحشرات عدة مرات مع برنامج تلفزيوني الباردة وإضافة تعليق الخلية إلى أنبوب 50 ملليلتر.
المقبل الطرد المركزي نخاع العظام وإزالة عظمى مع فراغ وماصة زجاجية. Resuspend بيليه الخلية في 5 ملليلتر من برنامج تلفزيوني. باستخدام ماصة، ببطء إضافة نخاع العظام المعلقة إلى الجزء العلوي من درجة حرارة الغرفة بولي السكروز.
بعد ذلك، تدور بولي السكروز في 400 GS لمدة 20 دقيقة مع الفرامل إيقاف. بعد الطرد المركزي، وجمع واجهة خلية أحادية النووية مجموع غائم مع ماصة ونقلها إلى أنبوب جديد 15 ملليلتر. جلب وحدة التخزين إلى 10 ملليلتر مع برنامج تلفزيوني وإزالة 20 ميكرولترات للعد.
بعد الطرد المركزي، والتخلص من عظمى ووضع بيليه على الجليد. المقبل ، resuspend بيليه الخلية في برنامج تلفزيوني مع EDTA وBSA. أضف ميكروبات CD117 إلى تعليق الخلية، ودوامة للمزج.
بعد هذا، احتضان تعليق لمدة 10 دقائق في 4 درجات مئوية. ثم جلب حجم يصل إلى 10 ملليلتر مع برنامج تلفزيوني أكثر مع EDTA وBSA والطرد المركزي في 1200 G في 4 درجات مئوية لمدة 5 دقائق. استخدام فراغ لإزالة عظمى وتعليق بيليه الخلية في برنامج تلفزيوني مع EDTA وBSA.
ثم إضافة 3 ملليلتر من برنامج تلفزيوني مع EDTA وBSA إلى موقف المغناطيس مع عمود مغناطيسي والسماح لها بالتدفق إلى أنبوب جمع. بعد انتهاء المخزن المؤقت المتدفقة خلال العمود، إضافة تعليق الخلية والسماح لها بالتدفق خلال العمود في أنبوب التجميع. أضف بعد ذلك 5 ملليلترات إضافية من PBS مع EDTA و BSA إلى العمود ومسحها على الفور مع المكبس.
إزالة المكبس وتكرار تدفق قبل عد الخلايا. بعد الطرد المركزي للخلايا، وإزالة supernatant وتعليق بيليه الخلية في IMDM كاملة للثقافة. ثقافة الخلايا بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون.
أولا، الجمع بين الحمض النووي البلازميد الفيروسي مع بلازميد التعبئة والتغليف، كلوريد الكالسيوم والماء في أنبوب 1.5 ملليلتر. ثم إضافة 500 ميكرولترات من HBS إلى آخر 1.5 ملليلتر أنبوب. إضافة الخليط transfection قطرة الحكمة إلى أنبوب يحتوي على HBS في حين الاختلاط في وقت واحد مع دوامة تعيين إلى أدنى الإعداد.
احتضان خليط transfection في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 إلى 30 دقيقة. خلال فترة الحضانة، إضافة الكلوروكين إلى خلايا HEK والاحتفاظ بها في الحاضنة. بعد إضافة مزيج transfection، احتضان الخلايا لمدة 8 ساعات في حاضنة 37 درجة مئوية 5٪ ثاني أكسيد الكربون تغيير وسائط الخلية عن طريق إضافة 14 ملليلتر من وسائل الإعلام DMEM10 الطازجة ببطء شديد.
الأنابيب ببطء ضد جدار الطبق يساعد على منع أي تجريد من خلايا HEK. ثم احتضان الخلايا بين عشية وضحاها في حاضنة 37 درجة مئوية 5٪ ثاني أكسيد الكربون. استخدام حقنة 10 ملليلتر لجمع افرا فيروسية.
ثم قم بتوصيل فلتر حقنة ميكرومتر 0.45 إلى الحقنة. يغرق المابير الفيروسية في أنبوب جمع جديد. جمع المابير الفيروسية ما يقرب من 16 ساعة في وقت لاحق.
بعد هذا، إضافة ملليلتر اثنين من جزء الليفية البشرية المؤتلف في برنامج تلفزيوني إلى غير المعالجة 6 لوحات ثقافة جيدا. في اليوم التالي، استخدم ماصة لإزالة الليفي من الأطباق. كتلة لوحات مع 2٪ BSA في برنامج تلفزيوني واحتضان لوحات في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة.
استخدام فراغ لإزالة BSA وغسل لوحات مع برنامج تلفزيوني قبل إزالته مع فراغ. بعد هذا، على الفور إضافة مصفاة الفيروسية الفائقة والطرد المركزي لوحة لمدة ساعتين. استخدام فراغ لإزالة افرانح وتدور لوحة مرة أخرى.
بعد إزالة supernatant مع فراغ وغسل الآبار المغلفة الفيروسية مع برنامج تلفزيوني. إزالة برنامج تلفزيوني مع فراغ، إضافة إلى زراعة سابقا ج كيب بالإضافة إلى خلايا الماوس إلى الآبار المغلفة الفيروسية. بعد الطرد المركزي، احتضان الخلايا في 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون.
بعد 48 ساعة من النقل، بيليه الخلايا عن طريق الطرد المركزي وإعادة تعليقها في FACS العازلة 1. أولاً ذوبان السليلوز الميثيل مع السيتوكينات للفئران في درجة حرارة الغرفة. ثم aliquot 3 ملليلتر من السليلوز الميثيل في أنبوب FACS.
إضافة 100 ميكرولترات من تعليق الخلية مع مثبطات مناسبة ل3 ملليلتر من السليلوز الميثيل. ثم دوامة تعليق على ارتفاع لمدة 10 إلى 30 ثانية. بعد معظم فقاعات الهواء الهروب، واستخدام حقنة 1 ملليلتر لوحة 1 ملليلتر من وسائل الإعلام في ثلاث لوحات تكرار.
ضع الأطباق في طبق بيتري كبير مع طبق مفتوح واحد يحتوي على مياه معقمة. ثم تغطية طبق بيتري كبيرة واحتضان الخلايا في 37 درجة مئوية. إعداد ايودونتروتترازوليوم وصمة عار كلوريد عن طريق حل 10 ملليغرام من كلوريد iodonitrotetrazolium في 10 ملليلتر من الماء.
تصفية تعقيم حل تلطيخ مع حقنة قفل Luer مجهزة مرشح 0.2 ميكرومتر. في غطاء محرك السيارة ثقافة الأنسجة، إضافة 100 ميكرولترات من حل تلطيخ قطرة الحكمة حول لوحة CFU. ثم احتضان لوحات بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية في حاضنة ثقافة الخلية.
وأخيرا، بعد أن تحولت المستعمرات لون بني أحمر داكن، واستخدام خلفية بيضاء في غطاء محرك السيارة ثقافة الأنسجة العقيمة لالتقاط صور للوحة CFU الملون. في هذا البروتوكول، تم استخدام العديد من تحليلات التعبير الجيني غير المتحيزة لتحديد المكون الجيني الذي ينسق إدمان الـ oncogene. للتحقق من دور c-Fos وDusp1 كهدف علاجي في سرطان الدم ، تم تأكيد فرط التعبير عنهما مع الخلايا التي تعبر عن BCR-ABL1 oncogene.
وأكد التحليل عن طريق RT-qPCR وغرب النشاف أن كلا من تم الناجمة عن BCR-ABL1 وأن يتم زيادة التعبير عن طريق عامل النمو IL-3. تم فرز YFP بالإضافة إلى الخلايا المعبرة عن طريق FACS لمزيد من المختبر وفي مقايسات الجسم الحي. وأظهرت النتائج أن حذف ج-فوس ودوسب 1 وحده يمنع أرقام الاتحاد.
وقد تعرضت الخلايا التي تفتقر إلى كل من C-Fos وDusp1 للخطر بشكل كبير في قدرتها على تشكيل مستعمرات، كما أن علاج Imatinib قضى على جميع وحدات CFUs التي تشير إلى أن فقدان C-Fos وDusp1 قاتل اصطناعيًا للتعبير BCR-ABL1. بعد هذا التطور، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال السرطان لاستكشاف الشبكات الجينية والجينات التي تقود الاعتماد على البكوجين وكيف تؤثر هذه الجينات على استجابتها الخاصة في نماذج الماوس والمرضى البشريين. لا تنس أن العمل مع الفيروسات الرجعية وعينات المرضى يمكن أن تكون خطرة للغاية ويجب مراعاة ممارسات المختبرات آمنة أثناء تنفيذ هذا الإجراء.
اعرض النص الكامل واحصل على الوصول إلى آلاف الفيديوهات العلمية
نظرة عامة
تصف هذه المقالة البروتوكولات الخاصة بالتحقق من c-Fos و Dusp1 كأهداف دوائية في سرطان الدم باستخدام أساليب وراثية وكيميائية. يمكن تطبيق هذا النهج على أنواع مختلفة من الأورام، مما يوفر رؤى حول اعتمادية الجينات المسببة للسرطان.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلوم
- علم الأورام
- علم الوراثة
- علم الصيدلة
الخلفية
- تحديد الجينات الرئيسية في اعتمادية الجينات المسببة للسرطان أمر حاسم للعلاجات المضادة للسرطان.
- يمكن تطبيق الطريقة على العديد من السرطانات المدفوعة بالكيناز.
- توجد تحديات للقادمين الجدد بسبب تعقيد البيولوجيا الجزيئية.
- يتضمن جمع ومعالجة عظام أرجل الفئران للتحليل.
هدف الدراسة
- للتحقق من c-Fos و Dusp1 كأهداف علاجية في سرطان الدم.
- لإظهار انطباق الأسلوب على أنواع أخرى من السرطان.
- لتعزيز فهم اعتمادية الجينات المسببة للسرطان في السرطان.
الأساليب المستخدمة
- بروتوكولات التحقق الجيني في المختبر وفي الجسم الحي.
- استخدام نماذج الفئران المإنسانة للاختبار.
- تقنيات التحقق الكيميائي لاستهداف الأدوية.
- جمع وتنظيف عظام أرجل الفئران للاستخدام التجريبي.
النتائج الرئيسية
- تحقق ناجح من c-Fos و Dusp1 كأهداف دوائية.
- رؤى حول دور اعتمادية الجينات المسببة للسرطان في سرطان الدم.
- منهجية قابلة للتطبيق على أنواع مختلفة من الأورام بخلاف سرطان الدم.
- تحديد التحديات للباحثين الجدد على الأسلوب.
الاستنتاجات
- توفر الدراسة إطارًا للتحقق الجيني في أبحاث السرطان.
- تدعم النتائج إمكانية العلاجات المستهدفة في سرطان الدم.
- يمكن تكييف الأسلوب لاستخدامات أوسع في علم الأورام.
الأسئلة الشائعة
Executive Industry Relevance
This method enables target validation in oncogene dependence, a critical inflection point in early discovery where mechanistic de-risking informs portfolio decisions. By genetically and chemically validating c-Fos and Dusp1 as synthetic lethal partners to BCR-ABL1, the approach provides predictive confidence for target prioritization in kinase-driven cancers. The protocol supports translational continuity from in vitro assays to humanized mouse models, facilitating risk-adjusted advancement of therapeutic candidates.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by validating genes whose deletion inhibits colony formation in oncogene-dependent cells.
- Operational Value: Provides a reproducible workflow for genetic validation using retroviral transduction and FACS-sorted YFP+ cells.
- Predictive Value: Demonstrates synthetic lethality where loss of c-Fos and Dusp1 combined with TKI treatment eradicates CFU formation, supporting go/no-go decisions.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates validated biological systems (c-Kit+ mouse cells transduced with YFP) suitable for downstream compound screening.
- Quantitative Outputs: Enables CFU counting and colony formation assays as quantitative readouts for target dependency.
- Scalability: Uses standardized methyl cellulose plating and triplicate replicates to support screening workflows.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Applies to leukemia models where BCR-ABL1-driven oncogene dependence is validated via genetic and chemical inhibition.
- Preclinical Continuity: Bridges in vitro target validation to in vivo efficacy in humanized mouse models, supporting IND-enabling studies.
- Risk Mitigation: Reduces mechanistic ambiguity by confirming target role through orthogonal methods (RT-qPCR, western blot, functional assays).
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target hypothesis to lead identification, providing validated models for mechanistic screening and predictive biomarker alignment.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by confirming that c-Fos and Dusp1 are induced by BCR-ABL1 and augmented by IL-3 signaling.
- Screening: Delivers assay-ready cells with quantifiable CFU outputs for evaluating compound effects on oncogene dependence.
- Analytics: Enables statistical comparison of colony formation across conditions using FACS-sorted populations and methyl cellulose assays.
- Translational Research: Connects target validation to preclinical models where genetic deletion synergizes with TKIs to eradicate disease.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for validating any genetic target in kinase-driven cancers beyond leukemia.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in oncogene dependence through genetic and chemical validation of c-Fos and Dusp1.
- Operational Value: Standardizes target validation via bone marrow harvest, retroviral transduction, and CFU assay workflows.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by demonstrating synthetic lethality that predicts therapeutic vulnerability.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets that show TKI sensitization upon inhibition.
Implementation Considerations
- Requires expertise in molecular biology, retroviral work, and hematopoietic stem cell isolation.
- Depends on instrumentation for centrifugation, FACS, and cytokine-supplemented methyl cellulose assays.
- Necessitates cross-team standardization for bone marrow processing and viral titer consistency.
- Involves adaptation considerations when applying to solid tumor models due to differences in cell sourcing and culture.
- Limited by biosafety requirements for handling retroviruses and primary patient samples.
