بوليميريز الرقمية سلسلة من ردود الفعل المقايسة للتنوع الوراثي في مريض متفرقة مرجلات غدومي استخدام تنسيق رقاقة في أنبوب

يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال الاختبارات الجينية ، مثل الكشف عن الفسيفساء ، والاختبارات الجينية القائمة على الخزعة السائلة. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي الكشف عالي الإنتاجية عن جزء الأليل منخفض المتغير. تمتد الآثار المترتبة على هذه التقنية إلى تشخيص الأورام ، لأن اكتشاف الطفرات الورمية ذات الحساسية العالية يمكن أن يساهم في الطب الدقيق.

ابدأ هذه التجربة بإضافة 10 لترات من المخزن المؤقت لعينة الحمض النووي إلى أنابيب شريط مكون من 8 أنابيب. ثم أضف 1 ميكرولتر من سلم الحمض النووي إلى الأنبوب الأول من الشريط المكون من 8 أنابيب ، وميكرولتر واحد من عينة الحمض النووي الجيني لكل أنبوب من الأنابيب المتبقية. استخدم ملحق الصفيحة الدقيقة لخلط محتويات الشريط المكون من 8 أنابيب عن طريق الدوامة لمدة دقيقة واحدة.

ضع الشريط وأطراف الماصة وجهاز الهلام في أداة الرحلان الكهربائي. اضغط على زر البدء لبدء الجري. بعد التشغيل الكامل ، تحقق من المخطط الكهربائي على الشاشة للتأكد من أن العلامة السفلية الموجودة في المخزن المؤقت لعينة DNA قد تم تعيينها بشكل صحيح على المخطط الكهربائي.

إذا لم يكن الأمر كذلك ، فقم بتعيين العلامة يدويا في وضع الرسم الكهربائي للبرنامج. بعد ذلك ، في وضع المنطقة للبرنامج ، حدد منطقة حجم الحمض النووي الجيني لحساب تركيز الحمض النووي تلقائيا. أضف البادئات والمجسات والحمض النووي الجيني المصمم مسبقا إلى شريط جديد مكون من 8 أنابيب لتحقيق حجم إجمالي يبلغ 15 L.Pipette لأعلى ولأسفل للخلط.

أضف منصة التحميل على الرقائق المدمجة في الشريط المكون من 8 أنابيب جديدة ، ثم ضع شريط الأنبوب في اللودر التلقائي. تأكد من وجود اتصال بين الرقائق ومنصة التحميل. بعد ذلك ، ضع شريط تمرير التحميل في النظام الأساسي ، واستخدم سدادة لإيقاف شريط التمرير عن اللودر.

الماصة 15 لترا من خليط PCR بالقرب من طرف شريط التمرير ، ثم اضغط على زر اللودر لتشغيل اللودر لمدة دقيقة واحدة. قم بإزالة شريط الأنبوب من اللودر بعد التشغيل ، وضعه في محسن الختم. ادفع بعناية غطاء المنزلق وحافة الغطاء العلوي.

قم بتشغيل محسن الختم لمدة دقيقتين تقريبا. إذا كان الختم غير مكتمل ، ويشار إليه ببركة من السائل ، كرر الجري لمدة دقيقة إضافية. أضف 230 لترا من سائل الختم إلى الأنابيب.

ضع شريط الأنبوب في التدوير الحراري ، وقم بتشغيل تفاعل البوليميراز المتسلسل كما هو موضح في البروتوكول. إذا كان هناك توزيع غير متساو للأقسام الموجبة ، فاضبط درجة الحرارة أو مدة تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR). لاكتشاف وتحليل شدة التألق لمنتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل ، ضع شريط الأنبوب على رقصة الكشف ، وأضف 6 مل من الماء المقطر.

قم بإزالة أي فقاعات هواء مرئية باستخدام طرف ماصة. قم بتحميل الرقصة في الكاشف. في برنامج الكشف، حدد التألق والتجربة ثم عينة علامات تبويب NTC، وانقر فوق الزر تشغيل لبدء التشغيل.

بعد التشغيل الكامل ، قم بتأكيد مخطط الموضع والرسم البياني ومخطط مبعثر ثنائي الأبعاد. لجمع منتج PCR ، قم بإزالة سائل الختم من الأنبوب. أضف 100 لتر من المخزن المؤقت TE ، وقم بالدوامة بقوة لمدة 30 ثانية.

بعمل طرد مركزي للأنابيب لفترة وجيزة في جهاز طرد مركزي منضدية ، واستمر كما هو موضح في بروتوكول النص لإنهاء جمع منتج PCR. تظهر مخططات الموضع التي تم إنشاؤها بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل الرقمي تأليقا سداسيا أصفر في كل من المرضى وعينات الأب ، مما يشير إلى وجود متغير أليل APC T ، ولكن ليس في عدم وجود عنصر تحكم في القالب. يحتوي الحمض النووي الجيني للمرضى فقط على متغير C ، كما هو موضح في التألق الأخضر ل FAM.

كما تم تأكيده بشكل أكبر من خلال مخططات المبعثر ، فإن كل من المريض والأب إيجابيان ل HEX ، أو المتغير T ، في حين أن المريض فقط يظهر وجود جزء الأليل المتغير C.Patients ، أو VAF ، المحسوب بواسطة DPCR ، كان 13.2٪ مشابها ل 12.7٪ الذي تم تحقيقه بواسطة تسلسل الجيل التالي. من ناحية أخرى ، كانت VAFs لأولياء أمور المرضى والمتبرعين الأصحاء أقل من 0.1٪ تؤكد الفصادة الكهربائية لمنتجات DPCR المجمعة والمركزة أن حجم الجزء المتوقع هو 123 زوجا أساسيا في الحمض النووي للمرضى والآباء. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر الحفاظ على نظافة المقعد ، على سبيل المثال ، باستخدام وحدة تصفية المروحة.